槲皮素對心肌缺血再灌注大鼠氧化應激反應及心電圖的影響

宣學習，張 宇，張 華，張傳西，袁義強

缺血性心臟病是由冠狀動脈循環改變引起冠狀動脈血流和心肌能量代謝失衡導致的心肌損傷疾病，在心腦血管疾病中極為常見，且在老年人中發病率較高，以心絞痛、休克、心律失常及心力衰竭為主要臨床表現[1-2]。隨著人們生活水平的提高，冠狀動脈粥樣硬化呈年輕化趨勢，年齡較小人群中出現心肌缺血疾病愈發常見，臨床手術中及時發現并且對缺血的冠狀動脈實行血液再灌注可使組織器官功能恢復，有效降低死亡率。然而，一些情況下，冠狀動脈部分或完全急性阻塞后在一定時間內恢復血液流動，不僅不能恢復組織器官功能，反而使組織病理損傷加重，發生不可逆的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[3]。槲皮素(Quercetin，QU)是廣泛存在的黃酮類藥物，具有降低血壓、減少毛細血管脆性、擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量、對抗自由基等功效[4-5]。研究表明，槲皮素可以通過緩解炎癥反應，減少細胞凋亡，減輕腎臟缺血再灌注損傷[6-7]。但槲皮素對MIRI發生時氧化應激作用研究較少。本研究通過對氧化應激指標及心臟電活動的比較，探討槲皮素在MIRI發生時對心肌的保護作用，為缺血性心臟疾病的治療及預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量(250±50)g，購自廣州相觀生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(粵)2018-0043，適應性飼喂7 d。

1.1.2 實驗試劑及儀器 凋亡細胞原位末端轉移酶標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA檢測試劑盒、酶標儀均購自Thermo Fisher Scientific公司，兔抗大鼠單磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)抗體一抗、兔抗大鼠p-AMPK抗體一抗、兔抗大鼠結節性腦硬化復合物2(tuberous sclerosis complex-2，TSC2)抗體一抗、兔抗大鼠p-TSC2抗體一抗、兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體一抗、兔抗大鼠p-mTOR抗體一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均購自美國CST公司，UV-1200紫外分光光度計(上海美析儀器有限公司)，ECG-1350P型十二導聯心電圖機(上海光電醫用電子儀器有限公司)，光學顯微鏡(上海萬衡精密儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模及分組 將48只大鼠按隨機數字表法分為模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、陽性藥物組4組，每組12只，采用冠狀動脈結扎法建立MIRI模型[8]。建模前12 h禁食，用2%戊巴比妥對各大鼠進行麻醉，15 min后將其移至解剖臺上并呈仰臥位，分別捆綁上下肢并連接心電圖機，觀察心電變化。將各大鼠頸部、胸前備皮、消毒后，分離頸部氣管并插入氣管插管，調整呼吸機參數進行連接(呼吸頻率100次/min)。于第三脅或第四肋間順肋間隙的方向偏胸骨左緣的位置開胸，暴露心臟并打開心包，將5-0縫合線沿左心耳下方2 cm冠狀動脈前降支穿過，將一小段直徑1.5 cm的乳膠管墊于縫合線上，收緊縫合線、結扎冠狀動脈造成心肌缺血。縫合線下心肌顏色變暗，左心室缺血變白，心電圖ST段弓背向上抬高，說明心肌缺血成功，此過程持續30 min；剪斷縫合線，恢復灌注后，可見縫合線下左心室顏色由白逐漸變紅，心電圖ST回落，說明再灌注成功，此過程持續120 min，排除結扎前心電圖異常及未到觀察終點即死亡大鼠。剩余12只大鼠為假手術組，僅打開胸腔，不結扎冠狀動脈。建模結束后，假手術組大鼠剩余10只，模型組6只，槲皮素低劑量組7只，槲皮素高劑量組9只，陽性藥物組10只。

1.2.2 干預 槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、陽性藥物組分別用25 mg/kg 槲皮素、50 mg/kg 槲皮素、3 mg/kg依達拉奉經尾靜脈注射給藥，假手術組及模型組用等量生理鹽水尾靜脈注射給藥，每天1次，持續4周。

1.2.3 觀察各組大鼠心電圖 將大鼠四肢連接心電圖機，觀察30 min內心電圖變化情況。

1.2.4 計算各組心肌梗死面積 再灌注結束后，各組分別取3只大鼠心臟，用生理鹽水洗去血污，將心臟切成0.1～0.3 cm厚心肌片，將2片新鮮心肌橫斷面進行氯化硝基四氮唑藍(NBT)染色，于37 ℃溫孵15 min，其余心肌片于-80 ℃凍存。正常心肌組織變藍色而梗死心肌不著色，用Image Pro-Plus Version 4.5圖像分析軟件計算心肌橫斷面梗死面積及整個左心室心肌橫斷面面積，心肌梗死面積用橫斷面梗死部分占左心室心肌橫斷面積的百分比表示。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理變化 將剩余心肌片用生理鹽水漂洗、濾紙吸干后置于4%甲醛溶液中固定，經酒精脫水、石蠟包埋后切片，進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

（1）分別根據所設置的modelA：Logistic(A_P)=-2+6*X1+0.5*X2，A_P=exp(logit(A_P))/(1+exp(logit(A_P)))和modelB：Logistic(B_P)=-4+10*X1+2.5*X2，B_P=exp(logit(B_P))/(1+exp(logit(B_P)))產生樣本量足夠（例如50 000例）數據集，每個患者有三個變量值，即Xi 1,Xi 2,Pi。

1.2.6 TUNEL法觀察細胞凋亡情況 取心肌切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，常規處理左心室石蠟標本，凋亡心肌細胞胞核為熒光綠色，正常心肌細胞則為藍色。于200倍視野下統計凋亡細胞數和總細胞數，細胞凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.7 檢測ROS、MDA、SOD含量 處死各組剩余大鼠，取心肌組織100 mg，放入離心管中，制成10%的勻漿液，后置于高溫沸水浴箱內10min，取出后搖勻，3 500 r/min(半徑8 cm)離心10 min后，取上清檢測。嚴格按照各說明書進行操作，ELISA檢測試劑盒分別檢測ROS、MDA、SOD含量，取波長450 nm，酶標儀讀數，測定各孔吸光度值，根據標準曲線，分別計算ROS、MDA、SOD含量。

1.2.8 檢測AMPK、p-AMPK、TSC2 、p-TSC2 、mTOR、p-mTOR的表達情況 另取各組剩余大鼠心肌組織100 mg，提取總蛋白并進行蛋白定量，每孔道加入50 μg蛋白進行SDS-PACE電泳后轉膜，于5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h。后加入ECL試劑，進行數據分析，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心電圖變化比較 除假手術組外，其余各組造模過程中，縫合線收緊冠狀動脈前降支后，左心室呈灰白狀，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，30 min后剪斷縫合線恢復前降支血流，表明造模成功。假手術組心電圖正常，模型組心電圖有明顯的心律失常現象出現，槲皮素高劑量組、槲皮素低劑量組心律失常現象均有明顯改善，但略低于陽性藥物組，陽性藥物組心電圖表現較好。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖變化情況

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 大鼠心肌梗死面積組間比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌梗死面積均縮小，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌梗死面積縮小，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌梗死面積縮小，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

圖2 HE染色下各組大鼠心肌組織病理變化(×200)

2.4 各組心肌細胞凋亡率比較 各組大鼠心肌細胞凋亡率組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌細胞凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較(±s) 單位：%

圖3 TUNEL檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況(×200)

2.5 各組ROS、MDA、SOD含量比較 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD含量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與假手術組比較，模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均升高， SOD含量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均降低，SOD含量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組心肌組織ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD含量比較(±s)

2.6 各組AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的相對表達量比較 大鼠心肌組織p-AMPK、p-TSC2、p-mTOR相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對表達量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，p-mTOR相對表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，p-mTOR相對表達量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組及陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，p-mTOR相對表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與槲皮素高劑量組比較，陽性藥物組p-AMPK、p-TSC2相對表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，p-mTOR相對表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；AMPK、TSC2、mTOR表達情況組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

表4 各組大鼠心肌組織AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的表達情況比較 (±s)

圖4 Western Blot檢測各組大鼠心肌AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR表達情況

3 討 論

MIRI是由于冠狀動脈及其分支的粥樣硬化導致冠狀動脈狹窄甚至閉塞，引起心肌超微結構、能量代謝、細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應等一系列損傷變化，這些損傷在血管恢復灌注后更加突出，嚴重者出現心律失常甚至猝死[9]。一般認為MIRI發生與再灌注時氧自由基大量生成有關[10]。雷曉鳴等[11]研究表明，槲皮素能夠減輕血腦屏障損傷，減少ROS生成，改善大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究通過比較不同劑量槲皮素對MIRI后氧化應激相關因子及AMPK/TSC2/mTOR通路相關指標的作用，明確其在MIRI發生后對心肌的保護作用及機制。

線粒體是細胞能量物質生成儲存場所，可以進行正常物質調控，使體內自由基產生及清除處于動態平衡，而不對機體造成影響。當心肌缺血缺氧時線粒體無法進行正常有氧氧化及能量代謝，能量產生減少，血液重新灌注時，脂質過氧化反應增強，自身抗氧化能力減弱，氧氣在蛋白激酶C等催化下生成活性氧類物質及過氧化氫等，與此同時產生過量ROS、MDA，由于自由基的清除依賴SOD等抗氧化酶系統，過量ROS、MDA在消耗抗氧化酶的同時，仍有大量存在[12-13]。尹方等[14]研究表明，銀杏葉提取物含黃酮類物質，可以有效捕獲自由基，改善微循環，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷發生。另有研究表明，MIRI的發生常伴隨細胞凋亡，而丙泊酚聯合槲皮素可以提高氧化應激條件下心肌細胞抗氧化能力，減少氧化應激條件下心肌細胞凋亡[15-16]。本研究結果中，模型組心電圖出現明顯心律失常，槲皮素低、高劑量組心律失常現象有所改善，且槲皮素高劑量組效果更好；HE染色顯示，模型組心肌纖維排列紊亂，核裂解消失，而槲皮素低、高劑量組病理變化較輕；此外，槲皮素各劑量組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率及ROS、MDA含量較模型組均降低，而SOD含量升高，提示槲皮素可以清除自由基，降低過氧化反應，改善心電圖及心肌組織病理變化，與既往研究結果一致。

AMPK是細胞內重要的代謝傳感器，主要參與維持代謝應激下能量平衡和氧化還原穩態，與心臟能量代謝密切相關[17]。在缺血缺氧或氧化應激加強的情況下，AMPK被大量激活，磷酸化水平升高，從而引起TSC2激活，進而使mTOR活性降低[18]。由于mTOR是蛋白合成的重要通路，當其活性降低時，肌細胞相關蛋白合成受到抑制[19-20]。槲皮素可以通過抑制AMPK/TSC2/mTOR信號通路，緩解中腦動脈閉塞大鼠腦組織的異常自噬[21]。唐丹麗等[22]研究表明，痰瘀同治方可通過抑制因缺氧復氧而激活的心肌細胞AMPK/mTOR通路，對心肌發揮保護作用。本研究結果中，與模型組比較，槲皮素各劑量組p-AMPK、p-TSC2表達量降低，p-mTOR表達量升高，且槲皮素高劑量組效果更好，提示槲皮素可以通過抑制AMPK/TSC2/mTOR相關通路，降低MIRI心肌組織損傷，與既往研究結果相符。

綜上所述，槲皮素對MIRI后氧化應激反應具有一定抑制作用，可改善心電圖，減少心肌凋亡心肌損傷，其機制可能與抑制AMPK/TSC2/mTOR通路有關。