草果知母湯對戊四唑誘導癲癇大鼠海馬神經元的保護作用及RECK/GFAP/AKT信號通路的調節作用

張高煉，郭建輝，曾 敬，李 敏，陳 銳，張曉寧，劉姍姍，梁韡斌

癲癇是由于大腦神經元異常放電進而引起大腦功能障礙的一種慢性疾病，流行病學研究資料顯示，癲癇在發達國家的中位發病率約為45/10萬，而在中低收入國家約為50.4/10萬。據統計顯示，發達國家癲癇病人的無故單次或多次癲癇發作發生率達到了50/10萬～70/10萬，在貧窮國家這一比例可能會更高。目前，我國的癲癇發病率與發達國家癲癇發病率基本保持一致。 研究發現，癲癇的發病機制與頭部腫瘤、顱腦外傷、遺傳因素等相關，且隨著疾病進展，癲癇不僅危害病人生命安全，影響病人精神狀態，還會導致病人發生認知功能障礙[1]，在兒童病人的臨床表現中，癲癇對認知功能的影響則表現的更為明顯。研究證實，癲癇導致的認知功能障礙及疾病進展與海馬組織神經元損傷密切相關[2]。近年來不斷有學者報道，反轉錄富含半胱氨酸蛋白(RECK)/膠質纖維酸性蛋白(GFAP)/蛋白激酶B(AKT)通路與顱腦損傷、抑郁及癲癇等腦部神經細胞受損疾病的預后轉歸及惡化進展均密切相關[3]。有研究發現，RECK/GFAP/AKT通路與海馬組織細胞功能及神經元正常生理、生命活動密切相關[4-5]。本研究初步研究草果知母湯對戊四唑誘導的癲癇大鼠海馬神經元的保護作用及RECK/GFAP/AKT信號通路的調節作用，為草果知母湯在癲癇疾病中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只雄性SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，8周齡，體質量180～200 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑 草果知母湯由中藥飲片(草果4.5 g，知母6 g，半夏9 g，厚樸6 g，黃芩4.5 g，烏梅4.5 g，花粉4.5 g，姜汁25 mL)煎制而成，生藥含量為1 g/mL，購自北京同仁堂藥業；丙戊酸鈉(山東方明藥業集團股份有限公司)；戊四唑(上海超研生物科技有限公司)；尼氏染色液(上海恒斐生物科技有限公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(廣州捷威斯生物科技有限公司)；聚合酶鏈式反應(PCR)引物設計及合成(上海信帆生物科技有限公司)；RECK抗體(亞科因生物技術有限公司)；GFAP(普健生物科技公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AKT購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 DMi8-M熒光倒置顯微鏡(徠卡顯微系統貿易有限公司)；Sigma 3-18KS離心機(德國SIGMA公司)；SpectraMax iD3酶標儀(美谷分子儀器有限公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司)；S700/S700A石蠟切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；KEEBIO-VE186雙垂直電泳槽(上海金鵬分析儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 癲癇大鼠造模、分組及給藥方法 將大鼠隨機分為正常對照組、癲癇模型組、草果知母湯低劑量組、草果知母湯中劑量組、草果知母湯高劑量組及陽性對照組，每組15只。除正常對照組外，其余大鼠按照35 mg/kg腹腔注射戊四唑[6]，每日1次，連續28 d，按照Recine[7]標準對大鼠進行分級，若大鼠連續5次出現Ⅱ級及以上癲癇癥狀，則視為造模成功。造模完成后，草果知母湯低、中、高劑量組大鼠按照2.5 mL/kg、5.0 mL/kg、10.0 mL/kg的劑量給予草果知母湯灌胃[8]，陽性對照組給予大鼠丙戊酸鈉65 mg/kg灌胃[9]，對照組及模型組按照10 mL/kg灌胃生理鹽水，每日1次，給藥4周[9]。

1.4.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平 取各組大鼠部分海馬組織，用RNA提取試劑盒提取大鼠海馬組織的總RNA，并將總RNA逆轉錄成cDNA，以GAPDH為內參，熒光定量PCR檢測海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達。各基因引物見表1，結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 各檢測基因引物序列

1.4.3 尼氏染色法檢測大鼠海馬神經元尼氏小體 取各組大鼠海馬組織，經石蠟包埋后進行4 μm切片，石蠟切片經二甲苯脫蠟后使用梯度乙醇脫水后，使用1%焦油紫染料室溫孵育30 min，70%乙醇分色1 min，梯度乙醇脫水，DPX封片劑封片后在顯微鏡下觀察，尼氏體呈紫色，細胞核呈淡紫色。

1.4.4 TUNEL染色法檢測大鼠海馬神經元凋亡水平 取大鼠海馬組織，石蠟包埋切片，常規脫蠟處理，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗兩次，使用Proteinase K工作液室溫反應30 min，PBS洗兩次，加入預先制備好的TUNEL反應混合液，37 ℃的濕化室中孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，避光孵育15 min，使用熒光顯微鏡進行觀察。計算細胞總數和凋亡細胞數并記錄平均值，凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平 取各組大鼠海馬組織，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進行勻漿，以4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于100 ℃沸水中水浴5 min變性，BCA法測定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進行電泳分離，經轉膜、封閉液封閉后，RECK、GFAP、p-AKT、AKT及GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝膠成像儀成像后，使用Image J 1.52v軟件進行灰度值檢測及分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比較 癲癇模型組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA較正常對照組明顯降低(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA較正常對照組大鼠明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA明顯升高(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA明顯降低(P<0.05)，且隨著草果知母湯劑量的增加，癲癇大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA逐漸升高(P<0.05)，海馬組織Bax及Caspase-3 mRNA逐漸降低。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比較(±s)

2.2 尼氏染色法觀察各組大鼠海馬神經元尼氏小體 正常對照組大鼠尼氏小體數量正常，海馬錐體細胞排列整齊，結構完整；與正常對照組比較，癲癇模型組大鼠及陽性對照組海馬錐體細胞數量減少，排列分散，結構模糊，尼氏小體染色淺，尼氏小體大量丟失；與癲癇模型組比較，草果知母湯各劑量組尼氏小體染色豐富，錐體細胞結構完整，排列較整齊。詳見圖1。

圖1 尼氏染色法檢測各組大鼠海馬神經元尼氏小體(A為正常對照組；B為癲癇模型組；C為草果知母湯低劑量組；D為草果知母湯中劑量組；E為草果知母湯高劑量組；F為陽性對照組)

2.3 各組大鼠海馬神經元凋亡指數比較 癲癇模型組大鼠海馬神經元凋亡指數較正常對照組明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠海馬神經元凋亡指數明顯降低(P<0.05)，且海馬神經元凋亡指數隨著草果知母湯劑量的增加而逐漸降低。詳見圖2。

與正常對照組相比，＊P<0.05；與癲癇模型組相比，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組相比，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組相比，☆P<0.05。圖2 各組大鼠海馬神經元凋亡指數比較(A為熒光顯微鏡下觀察；B為各組海馬神經元凋亡指數比較的柱狀圖)

2.4 各組大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比較 與正常對照組比較，癲癇模型組大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平明顯降低(P<0.05)，而GFAP水平則明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平明顯升高(P<0.05)，GFAP水平則明顯降低(P<0.05)，且隨著草果知母湯劑量的增加，大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平逐漸升高，GFAP水平則逐漸降低。各組大鼠海馬組織AKT水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3。

與正常對照組相比，＊P<0.05；與癲癇模型組相比，#P<0.05； 與草果知母湯低劑量組相比，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組相比，☆P<0.05。圖3 各組大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比較(A為大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平表達條帶圖；B為各組大鼠海馬組織RECK、 GFAP、p-AKT、AKT水平比較的柱狀圖)

3 討 論

癲癇是目前臨床上最常見的嚴重神經系統疾病，不但對病人身心造成嚴重傷害，也給病人家庭及社會帶來負擔，截至目前全球癲癇病人約有6 000萬人。由于目前臨床使用的抗癲癇藥物治療效果有限，接受藥物治療后緩解病人的復發率也缺少流行病學研究，需要進一步研究癲癇病人的發病機制，尤其是對突發性癲癇病人和已建立耐藥性的癲癇病人進行深入研究及跟蹤隨訪，并加速抗癲癇藥物的研發。戊四唑誘導的癲癇大鼠模型是近年來實驗室常用的建立實驗室癲癇動物模型的一種方法，采用腹腔注射給予大鼠35 mg/kg戊四唑方法建立癲癇模型大鼠，安全性好且造模成功率高[10-11]。丙戊酸鈉作為一種臨床常用抗癲癇藥物，其應用范圍廣且藥理機制較明確，所以本實驗使用丙戊酸鈉作為陽性對照藥物。

中醫理論認為癲癇作為一種“癇病”，是由于脾腎虧虛及痰氣郁結引起的氣血津液運行不利，加之情志刺激，發為癇疾。中醫藥學者認為，對于癇病的治療應以具有清肝利膽、活血安神、滋陰養液等功效的中藥為主。草果知母湯出自《溫病條辨》，中醫學認為其具有燥濕清熱等功效。方中草果具有溫散濕濁之功效，厚樸、半夏、姜汁和胃化濁，知母、天花粉則能夠清瀉胃火養陰，黃芩及烏梅清肝瀉火、斂肝生津，并防耗散陰津，諸藥調和，起到燥濕清熱的作用。現代藥理學研究發現，其具有較強的抗癲癇作用，對于各種大發作、小發作均有明顯效果[12]。在臨床應用中，草果知母湯在癲癇的治療中也已表現出明顯效果。戴克銀等[13]研究表明，草果知母湯在臨床應用中表現出明顯療效，其能夠明顯改善癲癇病人的認知功能，減少發病次數，并改善精神狀態及生活質量。張麗萍等[14-16]研究發現，草果知母湯對癲癇大鼠具有一定的神經元保護作用，并能夠調節海馬組織凋亡基因及抗凋亡基因的表達。Bax、Bcl-2及Caspase-3基因都是與細胞凋亡過程相關的重要基因，其中，Bcl-2作為抗凋亡基因抑制細胞的凋亡，而Bax 及Caspase-3則為促凋亡基因，能夠誘導細胞凋亡。本實驗通過建立戊四唑誘導的癲癇大鼠模型，并給予癲癇大鼠不同劑量的草果知母湯，結果表明，草果知母湯低、中、高劑量組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA水平逐漸升高，而海馬組織Bax及Caspase-3 mRNA水平則逐漸降低，提示草果知母湯能夠呈劑量依賴性地促進Bcl-2的表達，抑制Bax 及Caspase-3的表達，調節海馬組織細胞凋亡相關基因的表達，進而抑制海馬神經元凋亡，發揮海馬神經元保護作用。

海馬組織是大腦認知、學習及記憶能力的功能組織。研究發現，在由癲癇導致認知功能障礙的病理進展中，海馬神經元對其疾病進展及預后起到至關重要的作用[17]。同時海馬組織相關蛋白通路的變化又能夠影響海馬神經元的正常生理活動，所以，通過調節海馬神經元凋亡相關基因水平及多種細胞生命活動所必需的蛋白通路進而發揮對海馬神經元的保護作用，是目前治療癲癇引起的認知障礙藥物研發的思路之一。本實驗研究結果表明，給予癲癇模型大鼠不同劑量的草果知母湯后，大鼠海馬組織病理學明顯改善，同時癲癇大鼠海馬組織神經元凋亡率明顯降低，提示草果知母湯能夠修復癲癇大鼠海馬組織尼氏小體損傷，降低海馬組織神經元損傷凋亡，保護并修復戊四唑誘導的癲癇大鼠海馬神經元損傷。

GFAP被證明是與癲癇大鼠神經損傷密切相關的蛋白。癲癇病人的腦損傷病理進展與星形膠質細胞有關，星形膠質細胞會隨著腦損傷的病理變化進而出現以肥碩與增生為主要特征的反應性細胞，而GFAP則是該反應性細胞的主要標志蛋白。GFAP是癲癇腦損傷狀態的標志物，同時又是癲癇引起腦損傷疾病進展的標志，并反映抗癲癇藥物的治療效果。盧萬可等[18]研究表明，癲癇大鼠腦損傷是GFAP表達升高，而抑制GFAP的過表達則能夠起到降低大鼠腦損傷的作用。RECK基因由20個外顯子及21個內含子組成，是互補DNA編碼的膜錨定糖蛋白，共有971個氨基酸組成，近年來研究表明，其在頭頸部腫瘤及乳腺癌等疾病的發病機制中起到重要作用，并能夠通過影響基質金屬蛋白酶等機制參與血管生成、組織重塑、細胞增殖、凋亡等生命活動[19-21]。Du等[3]進一步研究發現，癲癇大鼠海馬組織損傷與RECK蛋白表達異常有關，通過激活RECK蛋白的表達能夠降低大鼠海馬組織損傷；AKT通路參與了癲癇發病過程中神經元異常放電及病理形成過程，AKT通路活化則能夠促進神經元的修復，抑制神經元的凋亡及損傷。張思遠等[22]研究表明，激活癲癇大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路及相關蛋白能夠調節凋亡相關基因的表達，進而起到抗癲癇及保護海馬神經元的作用。本實驗結果表明，草果知母湯各劑量組大鼠海馬組織RECK及p-AKT蛋白水平升高，GFAP水平降低，而海馬組織AKT蛋白水平無明顯變化，提示草果知母湯能夠呈劑量依賴性地促進癲癇大鼠海馬組織RECK及p-AKT的表達，抑制GFAP水平，推測草果知母湯能夠通過抑制海馬神經元病理性變化，同時促進AKT蛋白的磷酸化水平，并促進細胞增殖，表明草果知母湯能夠通過調節RECK/GFAP/AKT通路，進而發揮其神經元保護作用。

綜上所述，草果知母湯能夠降低戊四唑誘導的癲癇大鼠海馬神經元凋亡，調節凋亡相關基因表達水平，其機制可能與調節RECK/GFAP/AKT信號通路有關。由于時間及資金條件的限制，本實驗未能考察草果知母湯對癲癇大鼠RECK/GFAP/AKT信號通路的靶向調節作用，在今后的實驗中將對上述問題做進一步的闡述說明。