心力衰竭病人TLR4/NF-κB信號通路、vWF、D-二聚體水平變化及其與心力衰竭程度、LVEF的相關性分析

梁魏昉

心力衰竭是作為各種器質性心臟病的終末階段，發病率及病死率較高[1-2]，研究表明，免疫炎癥反應及炎癥細胞浸潤為心力衰竭發生發展的病理機制之一，尤其是炎癥反應及其造成的血流動力學紊亂是促進心臟重構及心功能惡化的重要因素，可作為反映病情進展及預后的獨立預測因子[3-4]。近年來研究發現，Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)/核轉錄因子(nuclear transcription factors，NF-κB)信號通路介導的免疫炎性反應的激活可促進動脈粥樣硬化、心肌缺血(再灌注損傷)等心血管疾病的發生、發展[5]。另有研究指出，心力衰竭病人炎癥反應引起的血流動力學異常，血液呈高凝狀態，其體內存在明顯內皮功能損傷，且損傷程度與心力衰竭程度一致[6]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是內皮功能損傷標志物，D-二聚體(D-dimer，D-D)為機體交聯纖維蛋白降解產物，為反映機體凝血功能的指標之一[7-8]。基于此，本研究觀察心力衰竭病人TLR4/NF-κB信號通路、vWF、D-D水平變化，并探究其與心力衰竭程度、左室射血分數(LVEF)的關系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月—2020年10月我院收治的128例心力衰竭病人作為研究對象，均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》中心力衰竭相關診斷標準[9]，并經臨床病史、癥狀、體征及實驗室、影像學等檢查確診。按照美國紐約心臟病協會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級，其中Ⅱ級40例，Ⅲ級56例，Ⅳ級32例。排除標準：①近3個月內有較嚴重創傷或手術者；②合并腦血管疾病者；③伴有肝腎功能不全者；④合并急慢性感染、慢性阻塞性肺疾病者；⑤合并妊娠、內分泌疾病者；⑥心臟起搏器植入者；⑦伴有先天性心臟病、風濕性心臟病、心包病變、重度心臟瓣膜病者；⑧超聲心動圖檢查圖像質量較差，無法做出準確判斷者；⑨合并惡性腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 通過病案系統收集病人入院時臨床資料，包括年齡、性別、體質指數、吸煙、飲酒、合并癥(糖尿病、高血壓、冠心病)、空腹血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.2 血清指標檢測 清晨空腹狀態下抽取2 mL肘靜脈血，3 000 r/min離心處理10 min，離心半徑為15 cm，分離血清、血漿，采用凝血儀及其配套試劑盒(日本Syxmex公司生產，CA6000型)以免疫比濁法測定D-D水平；采用全自動生化分析儀及其配套試劑盒(瑞士羅氏E170型)以酶聯免疫吸附法檢測vWF水平；采用電化學發光全自動免疫分析儀(瑞士羅氏Elecsys-2010)測定B型利鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、氨基酸末端B型利鈉肽前體(plasma N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)，計算BNP/NT-proBNP；以實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)測定外周血單核細胞TLR4、NF-κB mRNA；由美國Invitrogen公司提供的trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應，RT-qPCR儀(美國ABI公司7300型)擴增，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，同時以RT-qPCR儀器自帶分析軟件獲得各樣本、各基因擴增Ct，以β-actin作為內參照基因，目的基因表達相對值RQ=2-△△Ct。操作嚴格遵循儀器及試劑盒說明書進行。

1.2.3 超聲心動圖檢查 采用彩色多普勒超聲診斷儀(PHILIPS5500型)，探頭頻率1～5 MHz，參考美國超聲心動圖指南[10]進行測量，以實時三維超聲心動圖采集動態圖像，脫機計算LVEF。

2 結 果

2.1 不同心功能分級心力衰竭病人臨床資料比較 不同心功能分級心力衰竭程度病人年齡、BNP/NT-proBNP、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 不同心功能分級心力衰竭病人臨床資料比較

(續表)

2.2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF與心力衰竭嚴重程度的相關性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與心力衰竭程度呈正相關(P<0.05)，LVEF與心力衰竭程度呈負相關(P<0.05)。詳見表2。

表2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF與心力衰竭嚴重程度的相關性

2.3 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與LVEF、BNP/NT-proBNP的相關性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與LVEF呈負相關(r=-0.707，P<0.05；r=-0.780，P<0.05；r=-0.728，P<0.05；r=-0.898，P<0.05)，與BNP/NT-proBNP呈正相關(r=0.644，P<0.05；r=0.618，P<0.05；r=0.609，P<0.05；r=0.831，P<0.05)。詳見圖1～圖8。

圖1 TLR4 mRNA表達與LVEF的相關性分析

圖2 NF-κB mRNA表達與LVEF的相關性分析

圖3 vWF與LVEF的相關性分析

圖4 D-D與LVEF的相關性分析

圖5 TLR4 mRNA表達與BNP/NT-proBNP的相關性分析

圖6 NF-κB mRNA表達與BNP/NT-proBNP的相關性分析

圖7 vWF與BNP/NT-proBNP的相關性分析

圖8 D-D與BNP/NT-proBNP的相關性分析

2.4 心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素分析 以心力衰竭病人心力衰竭程度作為因變量(Ⅱ級賦值為1，Ⅲ級賦值為2，Ⅳ級賦值為3)，將年齡、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF水平作為自變量，納入Logistic回歸分析，自變量賦值：年齡<60歲=0，≥60歲=1；TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D以平均值為界，≤平均值=0，>平均值=1；LVEF以平均值為界，<平均值=0，≥平均值=1。Logistic回歸分析結果顯示，年齡、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、BNP/NT-proBNP、LVEF水平均為心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素分析

2.5 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF對心力衰竭程度的鑒別診斷價值 以ROC曲線獲取TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF鑒別診斷心力衰竭程度的AUC，結果顯示，各指標聯合診斷心功能Ⅲ級、Ⅳ級AUC分別為0.797，0.877，最佳敏感度分別為71.43%、75.00%，特異度分別為82.50%、93.75%。詳見表4及圖9、圖10。

表4 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF對心力衰竭程度的鑒別診斷價值

圖9 各指標診斷心力衰竭病人心功能Ⅳ級的ROC曲線

圖10 各指標診斷心力衰竭病人心功能Ⅲ級的ROC曲線

3 討 論

TLR作為參與特異性免疫的重要蛋白質分子，同時也是連接非特異性與特異性免疫的橋梁，在免疫炎性反應中發揮至關重要作用[11-12]。TLR4作為TLR家族重要成員之一，現已被作為心腦血管風險檢測標志物，其在心力衰竭發生、發展過程中過度表達，且其介導的一系列信號傳導通路致使病人心臟功能進一步減退[13]。TLR4信號傳導途徑根據接頭蛋白不同可分為髓細分化蛋白依賴性與非依賴性途徑，其中依賴性途徑主要引起NF-κB的激活及核轉位，并誘導炎癥相關基因表達[14-15]。此外，NF-κB激活后還可加速細胞間黏附分子轉錄及受損細胞間黏附作用，進一步擴大炎癥反應，形成惡性循環[16-17]。本研究中，TLR4 mRNA、NF-κB mRNA水平與心力衰竭病人心力衰竭程度呈正相關，分析原因，可能是由于免疫炎性反應始終貫穿心力衰竭發生與發展全過程，在心力衰竭病變過程中，TLR4/NF-κB信號通路過度激活，會產生大量免疫炎性因子進入血液循環，通過負性肌力作用，促使心肌細胞凋亡及心肌成纖維細胞增殖，加重心力衰竭程度。

有研究指出，TLR4的髓細分化蛋白依賴途徑可通過引起NF-κB的激活，易位進入細胞核內，誘導黏附分子、共刺激分子等促炎細胞因子產生，加重血管損傷，加之心力衰竭病人血液高凝狀態可促進下游免疫炎性因子對冠狀動脈血管浸潤，加重血管內皮損傷[18]，故推測心力衰竭病人TLR4/NF-κB與vWF、D-D水平有關。

D-D是一種由活化因子ⅩⅢ與纖維蛋白單體與中間聚合體交聯，經纖溶酶水解形成的特異性降解產物，為纖溶過程標志物，可調節纖溶酶及凝血酶活性變化，反映機體內凝血系統及繼發性纖溶系統的活性，判斷機體處于高凝狀態或纖溶亢進狀態[19-21]。血液中D-D水平越高表明高凝狀態越嚴重，進而致使機體心肌組織微循環障礙及缺氧缺血狀態加重，造成心肌纖維化、心功能損傷、左心室重構等一系列心臟變化，最終導致心力衰竭[22-23]。vWF主要由內皮細胞合成、分泌，生理狀態下參與止血的主要糖蛋白之一。在病理狀態下，vWF不僅參與高凝狀態形成，同時各類病理因素對血管內皮的復雜影響同樣反映在血漿vWF水平變化方面[24-25]。vWF為血管內皮損傷因子重要成員，其在結構上包含了多個巰基結構，可通過誘導氧化應激反應，促進下游糖蛋白配體激活，從而引起冠狀動脈血管內皮損傷，增加血管內皮下脂質沉積[26]。在血管內皮細胞完整性破壞的過程中，vWF大量釋放，誘導下游單核細胞或巨噬細胞激活，增加其對于冠狀動脈內皮下平滑肌細胞浸潤，致使平滑肌細胞痙攣[27]。已有研究證實，心力衰竭病人vWF水平高于健康對照組[28]，充分說明心力衰竭病人存在凝血功能異常、高凝狀態及血管內皮損傷?；诖?，本研究進一步分析心力衰竭病人vWF、D-D水平與心力衰竭程度的相關性，結果顯示，心力衰竭病人vWF、D-D與心力衰竭程度呈正相關，考慮原因，可能與心力衰竭病情發展過程中，免疫炎癥反應加劇，血管內皮損傷嚴重，血液持續處于高凝狀態有關。

本研究還顯示，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D與LVEF呈負相關，與目前公認的判斷心力衰竭嚴重程度的指標BNP/NT-proBNP呈正相關。心力衰竭病人心臟壓力容量負荷過重、心肌缺氧缺血及再灌注損傷均可引起心肌細胞表達下降，同時β受體下調也可影響心肌收縮、舒張功能，持續高度激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統與交感神經，引起心肌肥厚及心室重構。心室重構可進一步增加心肌損傷程度，進行性心肌重塑影響心室壓力負荷及局部血運障礙，造成LVEF降低，最終導致心室內相對瘀滯的高凝狀態。此外，本研究采用TLR4 mRNA、vWF、D-D、LVEF、NF-κB mRNA判斷心力衰竭病人心力衰竭程度，結果顯示，上述指標聯合判斷心力衰竭程度AUC最大，故臨床可實時監測心力衰竭病人vWF、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、D-D、LVEF水平變化，旨在為臨床治療方案選擇提供依據。

綜上所述，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D水平明顯升高，升高水平與心力衰竭程度、LVEF有關，且在心力衰竭程度判斷中具有重要意義，可為臨床治療方案及病情評估提供依據。