賴氨酰氧化酶家族在肝細胞癌發生發展中的作用

覃小賓，李祖隆，曾勝瀾，譚利婷，樂瀅玉，毛德文

1 廣西中醫藥大學 研究生院，南寧 530021； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科，南寧 530023

肝細胞癌(HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤，2018年全球HCC新發70余萬例，位居惡性腫瘤發病譜第6位，是全球第二常見的與癌癥相關的死亡原因[1]。由于HCC發現時通常已為晚期，加之目前治療手段有限，復發率極高，給我國造成了極大的經濟負擔。因此，HCC的早期監測識別及復發轉移的防治仍是我國醫學攻堅的重點。

腫瘤的發生和發展取決于腫瘤微環境，細胞外基質(extracellular matrix,ECM)作為腫瘤微環境的主要部分，與腫瘤細胞共同調控腫瘤微環境的異常表達，以及分泌多種生長因子、細胞因子和趨化因子，最終促進腫瘤的進展[2]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)是維持ECM穩態中的關鍵角色，通過催化膠原蛋白和彈性蛋白的共價交聯以維持ECM的硬度和結構穩定性[3]，在腫瘤中參與細胞信號和轉錄調節、腫瘤抑制和轉移促進、上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和免疫調節等多種生物學過程，在HCC中表達增加并與預后不良相關[4]。本文對LOX家族成員在HCC中的作用進行綜述，闡述其作為治療靶點的可能機制及中藥干預作用，以期為HCC的靶向藥物研發提供參考。

1 LOX家族成員的結構

在哺乳動物中，LOX家族是由LOX和LOX樣蛋白(LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4)組成的銅依賴性胺氧化酶，其成員均具有保守的銅結合位點、細胞因子受體樣結構域和賴氨酸酪醌輔因子組成的高度保守的羧基末端(C端)結構域，因此顯示出相似的胺氧化酶活性[5]。然而，LOX家族成員氨基末端(N端)結構域是可變的，幾乎無序列同源性。LOX和LOXL1在N端均含有1個前肽序列，LOXL2～4則在該區域存在4個清道夫受體半胱氨酸富集區(圖1)[5]。LOX及LOXL1的N端信號肽裂解產生的前原蛋白在內質網和高爾基體中發生N-連接的糖基化反應，然后通過分泌小泡的形式分泌至細胞外，被骨形態發生蛋白1或前膠原C金屬蛋白酶水解后產生活性酶和前肽(LOX-PP)，再重新進入細胞內以發揮其生物學活性[6]。盡管LOX-PP在催化LOX、LOXL1酶活性過程中具有重要作用，導致多種功能形式，但其對LOXL2～4的功能卻毫無影響，這可能是LOX家族成員功能具有相關性但不完全相同的原因[7]。

2 LOX家族在HCC中的促進作用

LOX作為預后不良的一種預測因子在HCC中過表達，其促進HCC進展可能是通過促血管生成、重塑腫瘤微環境和誘導EMT等完成的[13]。

2.1 促進血管生成

缺氧是實體瘤的特征，異常血管生成不僅改善了腫瘤的缺氧，并且促進了癌癥的進展。研究[14]表明血管生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其相關受體是腫瘤血管生成的主要正向調節劑，與不良預后密切相關。

2.1.1 LOX與血管生成 LOX通過p38MAPK信號影響TGFβ介導的VEGF在HCC細胞中表達上調，LOX基因敲除則抑制了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，并降低了VEGF表達[13]。LOX的表達水平在HCC中與肝臟基質硬度呈正相關，過表達的LOX上調了整合素β1的表達，并激活PI3K/Akt的磷酸化，增加了VEGF表達；同時激活整合素αV/β5/Akt-核Sp1通路，上調血管內皮細胞中血管生成因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)的表達，使VEGF與VEGFR2結合增加誘導血管生成，促進HCC的進展[15-16]。

2.1.2 LOXL1與血管生成 LOXL1在肝內膽管癌內表達升高，其通過與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸域依賴性機制中的αvβ3整聯蛋白結合，與調節血管生成的纖維蛋白5相互作用，增強黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)血管內皮細胞內MAPK信號通路，促進細胞增殖、集落形成和轉移，并誘導血管生成，LOXL1的敲除則顯示相反的效果[17]。

2.1.3 LOXL2與血管生成 LOXL2在HCC中過表達，誘導Snail信號-果糖-1,6-二磷酸酶通路上調缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的亞基HIF-1α活性增加，導致HIF-1α的靶基因VEGF表達增強，促進血管生成導致HCC轉移[18]。此外，LOXL2還可誘導內皮細胞沉積Ⅳ型膠原，并通過N端的重組清道夫受體富半胱氨酸結構域，使Ⅳ型膠原和纖連蛋白的相互作用獨立于酶的交聯活性，協調血管基底膜的支架，促進血管生成[19]。

2.1.4 LOXL4與血管生成 研究[20]表明，LOXL4在HCC中亦過表達，作為獨立危險因素與預后不良顯著相關，其在細胞外通過HCC來源的外泌體介導轉移到親代HCC細胞和內皮細胞上，從而增強HCC細胞的侵襲，促進血管生成，最終促進HCC轉移。

靶向LOX家族成員在抗HCC血管生成方面取得了重要進展，然而LOXL3對血管生成的影響尚不清楚，且目前的研究大多集中于單獨抑制VEGF途徑上，存在一定的局限性。新一代多靶點抗血管生成劑有待進一步的深入研究，最大限度發揮抗血管生成療法的潛力。

2.2 促進EMT

EMT導致上皮細胞失去其典型的極化狀態，細胞黏附和遷移能力增加，細胞凋亡受到抑制[21]。因此，調控EMT被認為是治療癌癥的新策略。

2.2.1 LOX與EMT 缺氧誘導HIF穩定和下游信號傳導，是EMT的重要驅動力[22]。HIF-1α誘導LOX在HCC內高表達，導致較高的復發率及較差的預后，其原因可能為LOX在HIF-1α介導下通過降低E-鈣黏蛋白，增加波形蛋白、Slug蛋白以及TWIST蛋白的表達誘導EMT，導致早期肝內轉移[23]。

2.2.2 LOXL2與EMT 與LOX作用相似，LOXL2也可通過降低E-鈣黏蛋白表達來促進EMT，不同的是，LOXL2以Snail蛋白依賴的方式誘導EMT[24]。此外，部分LOXL2可以移入細胞核與E-鈣黏蛋白啟動子的E-pal元件特異性結合，同時激活FAK/Src信號，獨立于其酶促活性而驅動EMT[25]。Wang等[24]研究報道了LOXL2表達較高的HCC患者總生存期較短，而Fan等[18]研究則認為LOXL2與HCC兩年內的早期復發顯著相關，但與HCC總生存期無關。二者存在爭議，仍需進一步研究明確。

LOXL1、LOXL3及LOXL4被發現在腫瘤中過表達，且LOXL1、LOXL3均能通過與Snail蛋白相互作用抑制E-鈣黏蛋白基因表達，誘導EMT以促進腫瘤增殖和轉移[26-27]。目前尚未有報道稱LOXL1、LOXL3在HCC中具有誘導EMT的作用，而LOXL4在腫瘤中是否能夠誘導EMT仍需進一步探究。

2.3 重塑腫瘤微環境

腫瘤微環境的改變不僅表現為基質硬度上的改變，更是導致了免疫狀態的改變，為腫瘤進展創造了有利條件。腫瘤微環境的調控不僅是目前的治療方式，也是未來的探索領域。

2.3.1 LOX與腫瘤微環境 ECM重塑在腫瘤微環境中是調控腫瘤瘤體硬度的關鍵機制，而Ⅳ型膠原蛋白的交聯則是ECM重塑中的重要過程。完整的Ⅳ型膠原蛋白網絡增強了ECM的硬度，為組織提供抗張強度，促進腫瘤生長并保護癌細胞免受化學療法誘導的凋亡[28]。Fang等[29]通過免疫組化及基于量子點的多重成像研究HCC患者肝組織，發現LOX的表達升高并誘導了腫瘤基質和癌巢周圍邊界中Ⅳ型膠原的線性重新排列，使ECM重塑并導致機械應力增加以驅動癌癥侵襲。

2.3.2 LOXL2與腫瘤微環境 LOXL2通過整聯蛋白介導的FAK使腫瘤微環境中的基質成纖維細胞活化，增加膠原收縮及平滑肌肌動蛋白的表達，導致組織硬度增加，活化Rho激酶并增強平滑肌肌動蛋白α收縮，調節細胞骨架重組，促進肝內轉移，同時增強募集骨髓來源的細胞歸巢到轉移部位以促進肝外轉移[30-31]。重要的是，隨著成纖維細胞活化增加，LOXL2表達亦增強，反之LOXL2表達的增強又促進成纖維細胞活化增加，由此形成一種正向循環進一步促進腫瘤的侵襲和轉移。此外，組織硬度的增加顯著增強了腫瘤微環境中M2巨噬細胞的極化，導致腫瘤微環境的免疫抑制[32]。因此，靶向腫瘤衍生的LOXL2可能是防止癌癥進展的新手段。

2.3.3 LOXL4與腫瘤微環境 LOXL4在肝內招募浸潤的巨噬細胞，通過依賴于IFN介導的STATS激活程序性死亡配體(PD-L1)的表達，從而轉化為免疫抑制表型，削弱細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫監視，導致免疫抑制微環境，促進HCC的發生發展[33]。除了在HCC細胞之間轉移，LOXL4還可在細胞內受TGFβ的誘導上調自身的表達，激活FAK/Src通路，促進HCC細胞與ECM中膠原蛋白的黏附，增強ECM硬度，導致HCC的遷移、侵襲和轉移[20]。Busnadiego等[34]研究則認為LOXL4可能在內皮下基底膜的膠原蛋白Ⅳ組裝中發揮作用從而促進細胞-基質黏附，其機制可能是通過Smad依賴和JunB/Fra2途徑表達增加并參與血管基質重塑。

盡管LOX與LOXL1～4之間在功能上存在一定的相似性，但目前關于LOXL1、LOXL3在HCC微環境中的具體調節機制未見論述。基于LOX家族在HCC發生發展中的重要作用，引發了研究者對研發靶向LOX家族成員治療HCC的新藥的極大興趣，但由于LOX家族在HCC中的作用較復雜，仍需進行大量的、更深入的研究以明確LOX家族在HCC中的具體效應機制，以指導臨床藥物研發。LOX家族成員在HCC中的促進作用總結詳見表1。

表1 LOX家族成員在HCC中的促進作用

3 LOX在HCC中的抑制作用

在以往的報道[35]中，LOX被認為是Ras癌基因的表型抑制因子，而后研究者[36-38]也在結腸癌、胃癌和前列腺癌細胞系中觀察到LOX表達降低，發現其啟動子甲基化和雜合性喪失而失活可能與腫瘤發病機制相關，提示LOX是一種腫瘤抑制基因。但LOX、LOXL1～3在HCC中是否具有抑癌作用尚未可知，仍需進一步的研究明確其在HCC中的效應機制。

3.1 LOX-PP在HCC中的抑制作用 LOX-PP已被證明在多種癌癥中具有抑制腫瘤發生的作用，其在HCC中低表達，是不良預后和晚期腫瘤的預測指標。LOX-PP過表達可下調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9和MMP-2表達，阻斷MAPK/ERK通路抑制癌細胞的侵襲和轉移[39]。Nareshkumar等[40]首次報道了LOX-PP在VEGF刺激下和未轉化的人臍靜脈內皮細胞中的過表達均使細胞增殖阻滯在DNA合成期，降低F-肌動蛋白水平，減少FAK的磷酸化，抑制下游NF-κB信號的激活，抑制細胞增殖、遷移、黏附和管狀形成，阻礙血管生成過程。因此，利用LOX-PP抗血管生成的作用可能為HCC治療提供新的思路。

3.2 LOXL4抑制HCC LOXL4在包括HCC在內的多種癌癥中過表達并促進腫瘤增殖和侵襲，但在膀胱癌和乳腺癌中可能起到腫瘤抑制因子的作用[41-42]，因此，LOXL4在腫瘤中的作用仍有待進一步探究。在具有野生型p53的HCC中，p53的轉錄活性受到抑制，其轉錄活性的重新激活是治療癌癥的潛在策略[43]。研究[44]發現，LOXL4在5-氮雜胞苷處理的HCC細胞系中表達上調，通過其低等電點區域與p53的堿性結構域結合，誘導受損的p53重新激活，導致腫瘤細胞死亡，且LOXL4的表達與HCC患者總生存期呈正相關。因此，LOXL4被認為在癌癥發生、進展和轉移過程中具有促進或抑制的雙重作用。在腫瘤發生過程中，LOXL4通過LOXL4-p53軸抑制腫瘤的生長，而在腫瘤進展過程中，p53可能會失去其功能，LOXL4的上調則會促進ECM重塑以促進腫瘤轉移。

4 中藥提取物通過調節LOX家族對HCC的干預作用

近年來，中醫藥在防治腫瘤方面取得了重大進展，中藥通過抑制細胞增殖和轉移、抗血管生成、調節免疫、誘導細胞凋亡和自噬等發揮抗腫瘤作用，具有多通路、多靶點、低毒副作用、費用低的優勢，有效地減輕患者臨床癥狀和延長生存期。現代藥理學研究表明，部分中藥提取物對LOX家族具有調節作用，從而起到抗HCC的作用。因此，對具有調節LOX作用的中藥進一步探索有望為治療HCC提供新的思路。

4.1 黃芩素 黃芩素是來自黃芩根的類黃酮化合物，具有抗氧化、抗細菌、抗病毒、抗炎和抗癌多種作用，廣泛運用于各種肝炎及HCC、乳腺癌、胃癌及大腸癌等癌癥治療中[45]。研究[46]表明，黃芩素通過下調在腫瘤中高度表達的血管生成誘導劑61及糖原合成激酶3β，介導Snail和Slug蛋白的泛素化，使依賴于Snail發揮作用的LOXL2表達受到抑制，增加E-鈣黏蛋白表達，導致EMT受到抑制，最終發揮抑制腫瘤轉移的作用(圖2)，但具體機制仍有待進一步的深入研究。

圖2 黃芩素干預HCC的作用示意圖

4.2 白藜蘆醇 白藜蘆醇是從虎杖、紅葡萄等植物中提取的多酚化合物，具有抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖和轉移、抑制血管生成、誘導細胞凋亡等作用，可通過調節AMPK/SIRT1促進蛋白酶體的降解，抑制HIF-1α累積，下調LOX表達，有效抑制HIF-1α誘導的肝纖維化和炎癥[47]。此外，白藜蘆醇還可抑制CCl4誘導的肝纖維化小鼠中LOXL2的表達，減少ECM膠原沉積，與β-氨基丙腈聯用可增強白藜蘆醇的抗肝纖維化作用(圖3)[48]。白藜蘆醇在HCC中可能是通過對膠原沉積的調控來重塑ECM，改善腫瘤微環境從而起到抗HCC轉移的作用，是潛在的治療靶點。

圖3 白藜蘆醇干預HCC的作用示意圖

4.3 紅景天苷 紅景天苷是從中藥紅景天中分離出來的一種苯丙苷類化合物，具有抗氧化和抗缺氧特性，在多種惡性腫瘤中表現出顯著的抗腫瘤活性。紅景天苷在HCC中可呈劑量依賴性顯著下調Notch1、Snail、COX-2、MMP-2、MMP-9基因表達，上調E-鈣黏蛋白表達，從而抑制HCC細胞的侵襲和遷移(圖4)[49]。體內外實驗[50]顯示，紅景天苷與奧沙利鉑共同給藥顯著抑制了HIF-1α信號通路，進而增加HCC細胞對鉑類藥物的敏感性，抑制缺氧誘導的EMT，提高了HCC患者的化療療效。鑒于此，筆者推測紅景天苷對HCC的調控作用可能通過HIF-1α/LOXL2途徑所實現，但仍需要進行更深入的研究。

圖4 紅景天苷干預HCC的作用示意圖

4.4 肉蓯蓉苯乙醇苷 中藥肉蓯蓉不僅具有補腎陽、益精血功效，從現代藥理學角度而言，其還具有抗腫瘤、調節免疫等多種特性，被廣泛應用于免疫調節。肉蓯蓉苯乙醇苷是肉蓯蓉主要活性成分之一，有報道[51]稱肉蓯蓉苯乙醇苷可降低荷瘤小鼠血清中AFP水平，具有良好的抑瘤作用。近年來，肉蓯蓉成為研發抗HCC藥物的新思路。Wen等[52]研究發現，肉蓯蓉苯乙醇苷聯合奧沙利鉑干預HepG2 HCC細胞模型可顯著下調HIF-1α、LOXL2和TWIST蛋白表達水平，上調E-鈣黏蛋白，改善HCC細胞的缺氧腫瘤微環境，同時提高HCC對化療的敏感性(圖5)，與紅景天苷的作用相類似。

圖5 肉蓯蓉苯乙醇苷干預HCC的作用示意圖

5 小結與展望

LOX家族成員氧化酶觸發的血管增生反應和積極的ECM重塑，通過介導髓樣細胞募集和建立轉移前利基，重塑腫瘤微環境進一步加快腫瘤發生和轉移，表明了其作為治療干預靶點的潛力，特別是在預防轉移方面，靶向該家族以防止腫瘤進展和轉移是一種有前景的治療策略。中藥在防治HCC中具有一定的優勢，部分中藥提取物能夠調節LOX家族，從而抑制腫瘤進展，成為HCC治療的潛力藥物。但目前關于中藥調控LOX家族的具體作用機制尚不明確，大部分研究僅針對某一關鍵蛋白表達水平即作出結論，較少對系統的多通路多靶點多蛋白進行研究。

此外，LOX家族不同成員對不同類型的膠原蛋白具有不同的底物特異性，且與其他蛋白質形成相互作用網絡，通過多個域協調不同的生物功能在癌癥中被重新連接，影響多種信號通路和細胞功能。因此，目前更重要的是建立網絡生物學研究來識別靶向LOX家族成員有效的生物標志物，深入了解LOX家族成員底物結合以及細胞反應所涉及的分子機制，確定何種干預以及何時進行干預能獲得更好的療效。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：毛德文、樂瀅玉負責研究選題；曾勝瀾、譚利婷參與收集數據，設計論文框架；覃小賓、李祖隆負責修訂論文；毛德文、覃小賓負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。