大王馬先蒿對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠的保護作用*

張春雷，吳新玉，王棟，陸倩，董莉，張金娟，廖尚高

(1.貴州醫科大學藥學院，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴安新區 550025；2.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點實驗室，貴陽 550004；3.貴州醫科大學基礎醫學院，貴安新區 550025)

肝纖維化是指由化學毒物性損傷、慢性肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒等因素引起的以肝內結締組織非正常增生為主要特征的病理生理過程[1]。中藥治療肝纖維化具有療效高、低毒副反應、費用低等優點，逐漸得到人們的重視[2]。TGF-β1/Smad信號通路在肝纖維化的發生及發展中具有重要作用，調控層粘連蛋白(laminin，LN)、透明質酸(hyaluronic acid，HA)及羥脯氨酸等蛋白的表達，最終導致肝纖維化的發生與進展[3]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是肝纖維化活化的標志物，Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I)主要反映肝纖維化程度[4]。大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.，PR)為玄參科(Scrophulariaceae)馬先蒿屬(Pedicularis)植物，臨床上用于慢性肝炎、肝硬化腹水等癥的治療[5-6]，現代研究表明，大王馬先蒿的化學成分主要為苯丙素、環烯醚萜、黃酮等[7]。基于肝纖維化是肝硬化的早期階段，筆者推測對肝硬化或肝硬化腹腔積液有療效的藥物可能對肝纖維化有效。因此，本研究擬進一步通過建立四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝纖維化模型，探討大王馬先蒿對CCl4誘導的小鼠肝纖維化體內作用，為大王馬先蒿抗肝纖維化的臨床應用及相關藥物的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1動物 清潔級昆明小鼠，60只，雄性，體質量(20±2) g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(黔)2018-0001；自由飲水，光照12 h/黑暗12 h，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%條件下飼養，適應性飼養1周后用于正式實驗。

1.2藥物和試劑 大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.Clark，PR)全株，經貴州醫科大學藥學院龍慶德副教授鑒定(批號：201910)。秋水仙堿(批號：S15A8C34051)購自上海源葉生物科技有限公司；CCl4(批號：L1602077)購自阿拉丁工業公司，臨用前用橄欖油稀釋；TGF-β1(批號：ab179695)，α-SMA(批號：ab124964)均購自美國Abcam公司，Smad3(批號：L1602077)，Collagen I(批號：10423R)均購自北京博奧森生物技術有限公司，GAPDH(批號：T0004)購自美國Affinity公司；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒(批號分別為20200109，20200110)購自南京建成生物工程研究所；透明質酸(HA)酶聯免疫吸附試劑盒(ELISA Kits)(批號：B16011450)，層粘蛋白(LN)酶聯免疫試劑盒(ELISA Kits)(批號：A22011449)購自武漢華美生物工程有限公司，PC-Ⅲ ELISA Kits (批號：L210104920)，IV-C ELISA Kits (批號：L210104913)購自武漢云克隆科技股份有限公司；4%多聚甲醛組織固定液(批號：69111800)購自Biosharp 公司。

1.3儀器 全波段多功能酶標儀(美國 Bio-Tek 公司，型號：ELX800)；移液器(德國 Eppendorf 股份公司，型號：P13199E)； XH-B 型旋渦混合器(江蘇康健醫療用品有限公司)；K30 型干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；CP124C 型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司，感量：0.1 mg]；Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(美國 Eppendorf 公司)；HK-UP-20 分析型超純水機(合肥宏科科技有限公司)；SIM-F140AY65 雪花制冰機(日本三洋電機株式會社)。

1.4藥材提取 大王馬先蒿樣品制備：稱取大王馬先蒿2 kg，第1次加95%乙醇提取2 h濾過，第2次加95%乙醇提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏備用。

1.5造模、分組及給藥[8]將60只雄性昆明小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組[9]及大王馬先蒿小、中、大劑量組，每組10只；大王馬先蒿組給藥劑量設置依據該藥臨床劑量(每天15～30 g)[10]，選擇每天26 g的臨床劑量換算成小鼠等效劑量小劑量[200 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]，再依次得出中劑量[400 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]與大劑量[800 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]。除正常對照組外，其余各組小鼠按照文獻[11]方法均腹腔注射經橄欖油稀釋的CCl4溶液(1 mL·kg-1)造模，每周2次，連續12周，正常對照組腹腔注射等體積橄欖油；實驗第5周，秋水仙堿組灌胃0.1 mg·kg-1秋水仙堿，大王馬先蒿小、中、大劑量組分別灌胃200，400，800 mg·kg-1大王馬先蒿提取物，正常對照組和肝纖維化模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉；每天1次，持續至第12周結束，期間密切觀察小鼠外表，活動狀態。

1.6血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平檢測 末次給藥1 h后，使用水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，待室溫沉降2 h后，3000 r·min-1離心15 min(r=5 cm)，分離血清，按照試劑盒說明書中的操作方法，檢測大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清AST、ALT、HA、LN、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平的影響。

1.7肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達檢測 小鼠取血后迅速在冰盤上取出肝組織，稱取固定部位的肝組織100 mg，經預冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加入RIPA細胞裂解液，置于冰水浴中進行裂解(20 min)，然后離心(10 000 r·min-1，15 min，r=5 cm)[12]；二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。取等量蛋白(10 μg)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，常規方法進行轉膜、封閉后，加入TGF-β1(1：1000)，Smad 3(1：1000)，α-SMA(1：1500)及Collagen I(1：500)一抗，4 ℃冰箱過夜后室溫孵育1 h；經緩沖液TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(二抗)，繼續室溫孵育1 h后，TBST洗膜(10 min×3次)，增強化學發光法顯影。采用圖像分析軟件分析各條帶吸光度值，通過目的條帶吸光度與內參(GAPDH)吸光度的比值進行半定量分析。

1.8蘇木精-伊紅(HE)，馬松(Masson)染色 實驗時取肝組織放入4%多聚甲醛中，后經乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后，行連續切片后封閉。常規方法進行HE和Masson染色，鏡下觀察肝組織病理形態。

2 結果

2.1大王馬先蒿對肝纖維化小鼠一般狀態的影響 實驗開始前，各組小鼠精神狀態好，活動能力強，毛色白，有光澤。隨著實驗的進展，由CCl4誘導的模型對照組小鼠出現形體消瘦，皮毛豎立，欠光澤，活動減少，反應遲緩，攝食量減少。實驗結束時，正常對照組毛色光澤，飲食如常，活潑好動；模型對照組小鼠明顯出現食欲減退，形體瘦弱，體質量減輕，豎毛，毛色略暗，反應略顯遲緩，呈現疾病狀態；秋水仙堿組、大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠，活動頻率如常，攝食一般。取肝臟組織后觀察發現，正常對照組肝臟表面光滑，透亮，無異常；模型對照組肝臟與周圍組織粘連明顯，邊緣圓頓，質地硬，肝臟表面呈彌漫的細小結節伴有淡黃色腹水；大王馬先蒿小、中、大劑量組和秋水仙堿組的情況對比模型對照組有所減輕。

2.2大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝臟和脾臟指數的影響 通過稱量小鼠的體質量、肝臟和脾臟的質量，按照公式：臟器系數=臟器質量/小鼠體質量×100%計算，本實驗采用肝臟指數，脾臟指數進行比較。肝臟受到損傷越重肝臟指數越高。和正常對照組小鼠肝指數和脾指數比較，模型對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。秋水仙堿組和大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠的肝指數和脾指數相比模型對照組降低，差異有統計學意義(P<0.01)。秋水仙堿組與大王馬先蒿各劑量組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠臟器指數的影響 Tab.1 Effect of Pedicularis rex on organ index in liver fibrosis mice

2.3大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型對照組小鼠血清 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST及ALT 水平升高 (P<0.01)，提示造模成功；與肝纖維化模型對照組小鼠比較，小、中、大劑量大王馬先蒿組與秋水仙堿組小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST、ALT水平均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組血清HA水平與藥秋水仙堿組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，其余各組無明顯差異。見表 2。

表2 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平的影響 Tab.2 Effect of Pedicularisrex on serum HA, LN, PCⅢ, Ⅳ-C, ALT and AST levels in liver fibrosis mice

2.4大王馬先蒿對CCl4性肝纖維化小鼠肝臟病理變化的影響 采用HE和Masson染色進行觀察，正常對照組肝組織結構清晰，肝小葉完整，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區僅有少量的纖維組織。肝纖維化模型對照組小鼠部分肝小葉結構紊亂，有脂肪空泡、大量炎癥細胞浸潤，并有假小葉形成，肝細胞普遍壞死，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。秋水仙堿組肝纖維化情況有所好轉，肝細胞索排列基本整齊，見少量的纖維間隔形成，肝細胞壞死減少，脂肪空泡減少，炎癥減輕，在匯管區觀察少量纖維組織增生。大王馬先蒿小、中、大劑量組與模型對照組相比，肝纖維化的現象有所好轉，匯管區膠原纖維增生減少，纖維間隔變窄，肝細胞壞死程度減輕，脂肪空泡減少，炎癥細胞浸潤減少，見圖1，2。

2.5大王馬先蒿對CCl4誘導肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1/Smad3信號通路，α-SMA及Collagen I表達的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型對照組小鼠肝組織 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I表達增加 (P<0.01)；與肝纖維化模型對照組小鼠比較，小、中、大劑量的大王馬先蒿組小鼠肝組織TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組與秋水仙堿組比較，Smad3及α-SMA表達水平較秋水仙堿組顯著降低(P<0.01)。見圖3、表3。

表3 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達的影響 Tab.3 Effect of Pedicularisrex on the expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I in liver tissue of liver fibrosis mice

A.正常對照組；B.模型對照組；C.秋水仙堿組；D.大王馬先蒿小劑量組；E.大王馬先蒿中劑量組；F.大王馬先蒿大劑量組。圖1 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝臟病理組織學的影響(HE，×200)A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.Pedicularis rex low-dose group；E.Pedicularis rex medium-dose group；F.Pedicularis rex high-dose group.Fig.1 Effect of Pedicularis rex on liver histopathology in liver fibrosis mice(HE，×200)

圖3 Western blotting檢測各組 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達Fig.3 Expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I proteins detected by Western blotting

3 討論

肝纖維化是肝臟受到各種慢性炎癥損傷時，肝細胞外基質異常分泌并沉積的可逆性創傷修復過程。腹腔注射CCl4出現肝損傷或壞死，從而導致肝纖維化的發生。通過CCl4誘導建立的肝纖維化動物模型，其肝組織在形態學、病理生理學等方面與人類肝纖維化相似。因此，用CCl4誘導動物肝纖維化模型，已被廣泛應用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機制的研究[13]。當肝功能受損時，可引起肝細胞損傷，細胞膜通透性增加，導致細胞內ALT、AST滲出進入血液，使其血液濃度明顯增加[14]，AST和ALT是肝功能損傷最敏感的指標。另一方面，由于HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C參與ECM合成，是肝組織正常結構被破壞的重要因素，肝纖維化過程常伴有肝細胞受損和HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯升高，檢測血清中這4種指標可準確、靈敏地反映肝內纖維生成的情況，是臨床診斷肝纖維化的敏感指標[15]。本實驗結果表明，大王馬先蒿可以有效降低肝纖維化模型小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST和ALT水平，表明大王馬先蒿具有保護肝臟免受損傷，降低肝纖維化的作用。另外，肝組織病理變化也說明大王馬先蒿給藥組減少了CCl4引起的膠原纖維增生和肝細胞變性，減少了肝臟切片中炎性細胞分布。另外，與CCl4誘導的模型對照組相比，大王馬先蒿給藥組還可降低小鼠的肝臟和脾臟指數，減輕臟器的腫脹及脂質化程度。以上結果都表明大王馬先蒿對CCl4誘導的肝纖維化小鼠具有較好的保護作用。

TGF-β1通過激活肝星狀細胞(HSC)和成纖維細胞生成細胞外基質(ECM)蛋白，是肝纖維化過程中的關鍵介質[16]。而Smad蛋白可將TGF-β1信號由細胞漿轉導至細胞核，從而調控LN、HA及羥脯氨酸等蛋白的表達，最終導致肝纖維化的發生與進展[17-18]。此外，α-SMA被認為是肝纖維化標志物、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白反映了肝纖維化程度，并參與一系列炎癥和纖維化的過程[19]。本研究實驗結果表明，灌胃給予肝纖維化模型小鼠小、中、大劑量大王馬先蒿后，模型小鼠肝組織TGF-β1、Smad 3、α-SMA及Collagen I蛋白表達水平明顯降低。這些結果表明，大王馬先蒿對CCl4誘導的肝纖維化小鼠的保護作用可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路，進而阻止肝星狀細胞活化，下調α-SMA和Collagen I蛋白表達有關。

綜上所述，大王馬先蒿對CCl4誘導的肝纖維化小鼠具有較好的保護作用，該作用與抑制TGF-β1/Smad信號通路及下調α-SMA和Collagen I蛋白表達有關。