冬凌草滴丸大鼠體內藥動學研究*

謝濤，楊婷，鄭大勇，李偉，于德紅，韓倩

(1.華北理工大學藥學院，唐山 063210；2.河南省人民醫(yī)院放療科，鄭州 450003)

冬凌草為唇形科(Labiatae)植物碎米椏Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara的干燥地上部分，收載于《中華人民共和國藥典》(2020版)中，其味苦甘，性微寒；歸肺、胃、肝經(jīng)；有清熱解毒、活血止痛的功效[1]。冬凌草的主要有效成分為二萜類化合物，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗腫瘤，抗炎、抗菌，抗氧化和免疫增強等藥理作用[2]，其中冬凌草甲素(Oridonin)與冬凌草乙素(Ponicidin)是其主要的兩種二萜類活性成分。

中藥滴丸是在中藥丸劑基礎上發(fā)展的一種新劑型，與傳統(tǒng)的中藥制劑相比較，具有生物利用度高、速效、高效、毒副作用小、制備簡單、安全性好等優(yōu)點[3]。冬凌草滴丸是由冬凌草精制而成的中藥滴丸制劑，進入《2019版國家醫(yī)保藥品目錄》，具有清熱解毒、消腫散結、利咽止痛的功效。用于熱毒壅盛所致咽喉腫痛、聲音嘶啞、扁桃體炎、咽炎、口腔炎等疾病。冬凌草滴丸對復發(fā)性口腔潰瘍、牙齦炎等有較為顯著的療效，其臨床應用已有相關文獻報道。鄧旭霞等[4]、CHEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草滴丸能明顯改善患者的牙齦紅腫、牙齦疼痛、牙齦出血等。且CHEN等[5]發(fā)現(xiàn)相較于冬凌草片，冬凌草滴丸療效更為顯著。同時，冬凌草滴丸中主要的兩種活性成分冬凌草甲素和冬凌草乙素在癌癥輔助治療方面已取得了較為顯著的療效[6-7]，可見冬凌草滴丸是非常有前景的中藥制劑。

目前，已有研究報道了幾種測定生物樣品中冬凌草甲素和冬凌草乙素的方法，包括高效液相色譜(HPLC)法測定兔血漿[8]和大鼠血漿[9]中的冬凌草甲素，犬血漿[10]中的冬凌草乙素，其定量限分別為20，50，20 ng·mL-1；高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)測定犬血漿中冬凌草甲素[11]、冬凌草乙素[12]，其定量限分別為12.5，5 ng·mL-1。其中包括了諾胃口服給藥、靜脈注射給藥等給藥方式，尚未有不同給藥劑量下冬凌草甲素和冬凌草乙素的藥動學研究。本文采用LC-MS/MS技術建立同時測定大鼠血漿中的冬凌草甲素和冬凌草乙素的方法，定量限更低，分別為2、1 ng·mL-1，并對大鼠灌胃給予小(0.3 g·kg-1)、中(0.9 g·kg-1)、大(2.7 g·kg-1)劑量以及累積劑量(0.9 g·kg-1，連續(xù)給藥7 d)的冬凌草滴丸后冬凌草甲素和冬凌草乙素的藥動學特征進行了研究，以期為冬凌草滴丸的臨床應用和進一步研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 冬凌草滴丸，河南百年康鑫藥業(yè)有限公司，批號：21191101，規(guī)格：每丸40 mg(含冬凌草甲素18.20 mg·g-1、冬凌草乙素0.61 mg·g-1)。

1.1.2儀器 AB Qtrap5500液質聯(lián)用儀(液相部分為島津UHPLC，其組成分別為LC-30AD二元泵，SIL-30AC自動進樣器，CTO-30A柱溫箱)；JW-3021 HR高速冷凍離心機(安徽省嘉文儀器裝備有限公司)，MX-S旋渦混勻儀(美國塞洛捷克)，Thermo Gen Pure xCAD Plus型超純水機。

1.1.3試劑 冬凌草甲素對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%，批號：111721-201704)、冬凌草乙素對照品(成都埃法生物科技有限公司，含量≥98%，批號：201901-190112)、苯海拉明(中國食品藥品檢定研究院，純度≥99.9%，批號：100066-200807)。甲醇(Merck KGaA，Darmstadt，Germany，LC-MS級)，甲酸(Sigma-Aldrich，Germany，LC-MS級)，整個實驗用水取自Thermo超純水機。

1.1.4動物 雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質量200～250 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0011。實驗前7 d，動物在室溫條件下[(25±2) ℃]，12 h明暗循環(huán))飼養(yǎng)，給藥前12 h禁食，給藥后及其他時間自由食用食物和水。所用實驗動物均通過華北理工大學實驗動物中心倫理審查，按照動物護理與使用指南進行操作，許可證號：SYXK(冀)2020-0038。

1.2方法

1.2.1分析方法 ①色譜條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為A(0.2%甲酸水)：B(甲醇)= 50：50(V：V)；流速為0.3 mL·min-1；洗脫時間為3.8 min(切換閥1.0～3.6 min進質譜)；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

②質譜條件。電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描，多反應監(jiān)測模式檢測(MRM)，離子噴霧電壓(ion spray voltage)為5500 V，離子源溫度(temperature)為500 ℃，Gas1：55，Gas2：55，氣簾氣(curtain gas)為30 kPa，射入電壓(EP)為10 V，碰撞室射入電壓(CXP)為 13 V。冬凌草甲素、冬凌草乙素和苯海拉明(內標，IS)的去簇電壓(DP)分別為80，120和50 V，碰撞電壓(CE)分別為13.5，16.5和20 V；用于定量的離子對分別為冬凌草甲素m/z365.3→347.3，冬凌草乙素m/z363.3→345.2，苯海拉明m/z256.3→167.2。見圖1。

圖1 冬凌草甲素(A)、冬凌草乙素(B)和苯海拉明(C)的質譜圖Fig.1 Mass spectrograms of oridonin (A), ponicidin (B) and diphenhydramine (C)

1.2.2溶液制備 ①對照品溶液制備。精密稱取冬凌草甲素、冬凌草乙素對照品適量，用甲醇溶解、稀釋，配制得冬凌草甲素、冬凌草乙素濃度分別為100 μg·mL-1，50 μg·mL-1的對照品儲備液，放于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩＂趦葮巳芤旱闹苽洹＞芰咳”胶＠?內標)1 mg，用50%甲醇溶液溶解、稀釋，配制得10 ng·mL-1內標溶液，即得。放于冰箱4 ℃保存，備用。

1.2.3分組給藥、血漿樣品采集及處理 ①給藥液配制。取冬凌草滴丸適量研磨成粉末，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉，超聲混勻，制得濃度分別為20，60，180 mg·mL-1的低、中、高3種劑量濃度的冬凌草滴丸給藥液，3種劑量分別含有冬凌草甲素、冬凌草乙素為0.364，0.012 mg·mL-1(低)；1.092，0.036 mg·mL-1(中)；3.276，0.108 mg·mL-1(高)。②給藥與血漿樣品采集。SD雄性大鼠24只，隨機分為4組，每組6只，分別為：小劑量組、中劑量組、大劑量組和中劑量多次給藥組，受試大鼠預適應1周，于實驗前12 h禁食不禁水。經(jīng)物種計量換算后，以冬凌草滴丸計，分別灌胃給予小劑量組(0.3 g·kg-1，臨床給藥劑量)、中劑量組(0.9 g·kg-1)、大劑量組(2.7 g·kg-1)3種劑量濃度的冬凌草滴丸給藥液，并于給藥前(0 h)和給藥后0.08，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采集靜脈血約0.2 mL；中劑量多次給藥組間隔24 h連續(xù)7 d灌胃給予中劑量的冬凌草滴丸給藥液(0.9 g·kg-1)，并于給藥后的每天早上給藥前取血0.2 mL，第7天給藥后，于給藥前(0 h)和給藥后0.08，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采集靜脈血0.2 mL。每次采血后即刻置于肝素化試管中，4000 r·min-1離心10 min，分離血漿(于-80 ℃冰箱中冷凍備測)。③血漿樣品處理。取大鼠血漿樣品50 μL，加入內標溶液50 μL，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心3 min，取上清乙酸乙酯層900 μL，于35 ℃下氮氣吹干，加50%甲醇溶液80 μL復溶，12 000 r·min-1離心5 min(r=5 cm)，取上清液70 μL至內插管中，進樣分析。

1.2.4方法學考察 ①專屬性考察。取空白血漿50 μL，除內標液以等量50%甲醇溶液代替外，其余按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作后進樣分析；取加入了冬凌草甲素、冬凌草乙素對照品溶液(含內標)的空白血漿、給藥后血漿樣品(冬凌草滴丸小劑量組給藥后8 h取血點)各50 μL，按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作并進行測定，得到相應色譜圖，確定血漿中內源物質對待測組分的干擾情況。

A.空白大鼠血漿色譜圖；B.空白大鼠血漿加入冬凌草甲素、冬凌草乙素和內標的色譜圖；C.大鼠血漿樣品測定色譜圖。峰1為冬凌草甲素；峰2冬凌草乙素；峰3為苯海拉明。圖2 冬凌草甲素、冬凌草乙素和苯海拉明的色譜圖A.Chromatogram of blank rat plasma；B.Chromatogram of blank rat plasma with oridonin, ponicidin and internal standard；C.Chromatogram of plasma sample.Peak 1, peak 2 and peak 3 were oridonin, ponicidin and diphenhydramine respectively.Fig.2 Chromatogram of oridonin, ponicidin and diphenhydramine

②標準曲線與定量限。取空白血漿50 μL，分別加入系列濃度的標準品溶液各50 μL，內標液50 μL，混勻后得到含冬凌草甲素分別為512，256，128，64，32，16，8，4，2 ng·mL-1和冬凌草乙素分別為256，128，64，32，16，8，4，2，1 ng·mL-1的標準血漿樣品，按照“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作，每一濃度平行6份，進行測定，記錄色譜圖。以待測物濃度為X軸，待測物與內標物的峰面積比值為Y軸，用加權(W=1/χ2)最小二乘法進行回歸運算。取空白血漿按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作，制備低濃度血漿樣品，計算色譜峰信噪比數(shù)據(jù)，連續(xù)進樣6次驗證(S/N>10)。

③精密度和準確度。取空白血漿50 μL，按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作制備小、中、大3個濃度的質量控制(QC)樣品。其中冬凌草甲素的濃度分別為4.25，65.00，410.00 ng·mL-1，冬凌草乙素的濃度分別為2.09，32.38，205.50 ng·mL-1。每一濃度平行6份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日的標準曲線，計算質控樣品的測得濃度，根據(jù)質控樣品的測定結果計算方法的精密度與準確度。

④提取回收率與基質效應。按“③精密度和準確度”項下制備低、中、高3個濃度的QC樣品，每一濃度各6份樣本，按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作，進樣分析，測定待測物峰面積與內標峰面積之比為A1(6次進樣平均值)；同時另取空白大鼠血漿50 μL，除不加內標溶液外，其余按“1.2.3”項下血漿樣品處理方法操作，向上清液中加入相應低、中、高濃度的標準溶液50 μL和內標溶液50 μL，渦流混合，35 ℃氮氣流下吹干，殘渣加50%甲醇溶液80 μL復溶，12 000 r·min-1離心5 min(r=5 cm)，取上清液70 μL至內插管中，進樣分析，測得待測物峰面積與內標峰面積之比為A2(3次進樣平均值)，則回收率R=A1/A2×100%；同法以流動相代替空白血漿以上述方法處理，進樣分析，測定待測物峰面積與內標峰面積之比為A0，則基質效應M=A2/A0×100%。計算內標歸一化的基質因子要求 RSD不得大于15%。

⑤穩(wěn)定性。取“③精密度和準確度”項下低、高兩個濃度的QC樣品(冬凌草甲素的濃度分別為4.25，410.00 ng·mL-1，冬凌草乙素的濃度分別為2.09，205.50 ng·mL-1)，每個質量濃度各3份，分別考察在室溫放置0，4，10，16，24 h的穩(wěn)定性；-80 ℃下經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)處理的穩(wěn)定性、-80 ℃下冷凍保存30 d的穩(wěn)定性、自動進樣器(4 ℃)中放置24 h后的穩(wěn)定性以及全血樣品(除以等量全血代替空白血漿外，與QC樣品同樣操作處理)在室溫、4 ℃、-20 ℃3種條件下放置1，3，5 d的穩(wěn)定性。

1.2.5藥動學研究 不同劑量組在大鼠體內藥動學研究給藥、取血方案和血漿樣品處理方法如“1.2.3”項所述，血漿樣品處理后按“1.2.1分析方法”項下所述方法進行檢測，計算不同時間點血藥濃度，繪制藥-時曲線圖，所得數(shù)據(jù)用 DAS 3.0版軟件進行處理，采用非房室模型計算主要藥代動力學參數(shù)。

2 結果

2.1方法學評價

2.1.1專屬性 冬凌草甲素與冬凌草乙素分別在2.98，1.70 min左右出峰，內標苯海拉明在2.11 min左右出峰，峰形對稱，表明血漿中內源性物質不干擾測定，專屬性強，色譜圖見圖2。

2.1.2標準曲線與定量限 冬凌草甲素的線性方程為：Y=0.00 204X+0.004 580，相關系數(shù)r=0.997，權重為1/χ2，在2～512 ng·mL-1濃度范圍內線性良好，定量限為2.0 ng·mL-1(S/N>10)；冬凌草乙素的線性方程：Y=0.002 12X+0.001 78，相關系數(shù)r=0.997，權重為1/χ2，1～256 ng·mL-1濃度范圍內線性良好，定量限為1.0 ng·mL-1(S/N>10)，能滿足血漿樣品中冬凌草甲素和冬凌草乙素的含量測定。

2.1.3精密度和準確度 低、中、高3個濃度生物質控樣品精密度與準確度良好，測得結果表明兩成分日內及日間RSD均不超過8.4%，準確度水平均大于98.70%，均符合生物樣品分析要求，結果見表1。

表1 大鼠血漿中冬凌草甲素和冬凌草乙素的準確度與精密度 Tab.1 Accuracy and precision of oridonin and ponicidin in rat plasma

2.1.4提取回收率與基質效應 低、中、高3個濃度的生物質控樣品回收率良好，冬凌草甲素的提取回收率為75.40%～82.40%，冬凌草乙素的提取回收率為75.30%～88.60%，兩成分RSD均不超過8.9%，符合生物樣品分析要求，基質效應考察結果為85.30%～105.31%，RSD<9.7%，未見內源物質干擾測定，結果見表2。

表2 大鼠血漿中冬凌草甲素和冬凌草乙素的提取回收率與基質效應 Tab.2 Extraction recovery and matrix effect of oridonin and ponicidin in rat plasma

2.1.5穩(wěn)定性 含藥血漿在室溫放置0，4，10，16，24 h，-80 ℃下經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)處理、-80 ℃下冷凍保存30 d和自動進樣器(4 ℃)中放置24 h后四種條件下，冬凌草甲素的低、高濃度血漿樣品RSD均不超過10.6%，冬凌草乙素的低、高濃度血漿樣品RSD均不超過11.3%，可見穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求，結果見表3。全血樣品在室溫4 ℃，-20 ℃3種條件下放置1，3，5 d的穩(wěn)定性良好，RSD均不超過11.7%，符合生物樣品分析要求，結果見表4。

表3 大鼠血漿中冬凌草甲素和冬凌草乙素的常規(guī)穩(wěn)定性Tab.3 Conventional stability of oridonin and ponicidin in rat plasma %，n=6

表4 冬凌草甲素和冬凌草乙素的全血穩(wěn)定性 Tab.4 Whole blood stability of oridonin and ponicidin n=6

2.2藥動學研究結果

2.2.1中劑量多次給藥組 給藥前6 d的血樣中未檢測到冬凌草甲素與冬凌草乙素，小、中、大劑量組中冬凌草甲素與冬凌草乙素的平均血藥濃度-時間曲線，見圖3。根據(jù)所得血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 26.0版軟件處理，藥動學參數(shù)分別見表5，表6。

表5 冬凌草甲素在大鼠體內的藥動學參數(shù)Tab.5 Pharmacokinetic parameters of oridonin in rats

表6 冬凌草乙素在大鼠體內的藥動學參數(shù)Tab.6 Pharmacokinetic parameters of ponicidin in rats

圖3 冬凌草甲素和冬凌草乙素的平均血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean blood concentration time curve of oridonin and ponicidin

2.2.2冬凌草滴丸 中劑量單次給藥與中劑量多次給藥后，冬凌草甲素的消除半衰期t1/2β分別為(2.54±1.17)和(2.85±0.82) h，冬凌草乙素的消除半衰期t1/2β分別為(2.56±0.45)和(2.73±0.62) h，均差異無統(tǒng)計學意義，藥時曲線對比見圖4。

圖4 單次給藥與多次給藥冬凌草甲素與冬凌草乙素的藥時曲線Fig.4 Drug concentration-time curves of single and multiple doses of oridonin and ponicidin

2.2.3置信區(qū)間法 分析小、中、大3個劑量組(0.3，0.9，2.7 g·kg-1)下，冬凌草甲素ln(Cmax)、ln(AUC0-t)與ln(Dose)的線性方程為Y=0.867X+5.272(R2=0.912)、Y=0.921X+5.431 (R2=0.942)；冬凌草乙素ln(Cmax)、ln(AUC0-t)與ln(Dose)的線性方程為Y=0.861X+3.552 (R2=0.904)、Y=0.961X+4.163 (R2=0.901)，斜率均接近1，見圖5，圖6。

虛線為90%置信區(qū)間，A.Cmax；B.AUC0-t。圖5 冬凌草甲素lnPK與ln(劑量)的線性關系The dotted line is the 90% confidence interval.A.The relationship between lnCmax and lnDose；B.The relationship between lnAUC0-t and lnDoseFig.5 The relationship between lnPK and lnDose of oridonin

3 討論

在本實驗中，首先探討了甲醇或乙腈[13]為溶劑的蛋白質沉淀法處理血漿樣品的效果，結果顯示樣品中冬凌草乙素低于方法的檢測限，且提取回收率較低，故選用液-液萃取法。分別考察乙酸乙酯、二氯甲烷[14]作為萃取劑的效果，結果顯示乙酸乙酯萃取的提取回收率較高為75.3%～88.6%，可能是乙酸乙酯的沸點(77 ℃)相較于二氯甲烷(39 ℃)更高，更加穩(wěn)定，所以選取乙酸乙酯作為萃取劑。冬凌草滴丸中劑量單次給藥和冬凌草滴丸中劑量多次給藥后，藥物吸收迅速，冬凌草甲素血藥濃度均約在0.2 h達最大值，t1/2β均約為2.5 h；冬凌草乙素血藥濃度均約在0.3 h達最大值，t1/2β均約為2.6 h，且單次給藥和多次給藥后，冬凌草甲素與冬凌草乙素的消除半衰期t1/2β均差異無統(tǒng)計學意義，說明長期給藥后冬凌草甲素與冬凌草乙素在大鼠體內的吸收、分布、代謝和排泄未顯著改變，不存在藥物蓄積的風險[15]。

虛線為90%置信區(qū)間；A.Cmax；B.AUC0-t。圖6 冬凌草乙素lnPK與ln(劑量)的線性關系The dotted line is the 90% confidence interval；A.The relationship between lnCmax and lnDose；B.The relationship between lnAUC0-t and lnDoseFig.6 The relationship between lnPK and lnDose of ponicidin

在研究中，冬凌草滴丸小劑量給藥后6 h、8 h，部分大鼠血樣中的冬凌草乙素濃度低于方法的定量限，故小劑量組中冬凌草乙素的部分藥動學參數(shù)無法獲得。經(jīng)統(tǒng)計學分析，在本實驗的小、中、大(0.3，0.9，2.7 g·kg-1)3個劑量組下，冬凌草甲素lnCmax、ln(AUC0-t)與ln(劑量)的斜率β(90%置信區(qū)間)分別為0.867(0.771，1.002)、0.921(0.841，1.096)，lnCmax斜率β略跨過判斷區(qū)間(0.839，1.161)，表明冬凌草甲素的Cmax有線性藥動學特征的結果尚無定論。ln(AUC0-t)斜率β包含在判斷區(qū)間(0.839，1.161)內，表明冬凌草甲素的藥動學參數(shù)AUC0-t有線性藥動學特征。冬凌草乙素lnCmax、ln(AUC0-t)與ln(劑量)的斜率β(90%置信區(qū)間)分別為0.861(0.775，0.956)、0.961(0.779，1.152)，斜率β均略跨過判斷區(qū)間(0.839，1.161)，表明冬凌草乙素的Cmax與AUC0-t有線性藥動學特征的結果尚無定論。

本實驗建立了同時測定大鼠血漿中冬凌草甲素與冬凌草乙素的LC-MS/MS方法[16-17]，該方法快速、準確、專屬性強。用所建方法對不同劑量冬凌草滴丸中冬凌草甲素、冬凌草乙素進行了大鼠體內的藥動學研究，研究結果可為冬凌草滴丸的臨床應用和進一步研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。在以后的的工作中需要進一步研究冬凌草滴丸中活性成分的組織分布規(guī)律、主要的蓄積器官以及蓄積程度進行深入研究探索；冬凌草滴丸是冬凌草的單方制劑，而冬凌草對多種腫瘤具有抗癌活性，因此可以研究冬凌草滴丸在抗癌、抗腫瘤方面的潛在功效。