基于網絡藥理學和分子對接技術探討四妙勇安湯治療冠心病的分子機制

葉招娣，周紹唐，徐 璐，劉中勇

心血管疾病(CVD)給社會帶來巨大的經濟負擔，動脈粥樣硬化是導致心血管疾病的主要原因，導致人群的高死亡率[1]。2017年的心臟病大會指出，冠心病的患病率呈攀升態勢，缺血性心臟病的患病率從2003年的0.46%提高到2015年的1.02%，增加了2倍多[2]。現有研究發現動脈粥樣斑塊中存在大量的炎性細胞浸潤[3]，而很多醫家認為機體的炎癥反應與中醫熱毒有相似之處，邪毒入絡，脈絡瘀阻，氣血運行不暢，郁而化熱，熱而傷陰，陰損及陽，叢生變證[4]。四妙勇安湯具有清熱解毒的功效，可治療熱毒脫疽，越來越多的研究表明，四妙勇安湯能夠抑制炎癥反應從而起到抗動脈粥樣硬化的作用。基于系統生物學理論的網絡藥理學可以更為系統地探究中藥復方的活性成分和作用靶點，指導基礎研究以及中藥新藥的研發。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯相關靶點篩選 通過檢索中藥系統藥理學技術平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)并下載中藥化學成分，根據口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的2個ADME屬性值進行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。篩選結束后，為標準化蛋白質靶點信息，統一在UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質靶點進行規范。

1.2 冠心病相關靶點篩選 冠心病相關靶點篩選以“cardiovascular disease”“coronary heart disease”“coronary artery disease”為關鍵詞在OMIM(http://www.omim.org/)數據庫和GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫進行篩選，合并疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到冠心病的疾病靶點。在GeneCards數據庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病聯系密切，若靶點過多則設定Score大于中位數的目標靶點為冠心病的潛在靶點[5]。

1.3 四妙勇安湯成分-冠心病靶點網絡圖 為探討四妙勇安湯藥物相關靶點與冠心病靶點間的相互作用，將得到的藥物有效成分及靶點與疾病的靶點進行合并，得到四妙勇安湯有效成分治療冠心病的靶點。將得到的靶點數據上傳至 Cytoscape 3.7.2軟件中，構建“藥物-成分-靶點”網絡圖。其中節點代表金銀花、玄參、當歸、甘草有效成分和靶點等，邊代表四味中藥成分與成分、成分與靶點之間、藥物與成分靶點之間的關系。

1.4 藥物-疾病核心蛋白相互作用(PPI)網絡構建 將藥物和疾病的交集靶點數據輸入至STRING數據庫(http：//string-db.org)中，將物種定義為“人”，構建四妙勇安湯治療冠心病的PPI網絡。將STRING數據庫文件導入至Cytoscape 3.7.2軟件中，并運用其內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等，以Degree值大于平均值為標準，篩選出核心靶點[6]。

1.5 功能富集與生物通路分析 將藥物和疾病的交集靶點數據傳輸至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫中，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“genelist”，種屬選為“Homosapiens”，之后選取“gene ontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”以及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本體(gene ontology，GO)生物過程的富集分析。

1.6 分子對接驗證 從RSCB數據庫(http://www．rcsb.org/)中下載白細胞介素6(IL6)和血管內皮生長因子(VEGF)的晶體結構，采用AutoDock Tools 1.5.6 軟件刪除IL6和VEGF復合物中水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計算Gasteiger 電荷，保存為pdbqt文件。從pubchem 下載小分子3D 坐標文件，在pymol 中檢查空間結構無誤后，利用openbabel 轉換為pdb 格式，將結構件載入AutoDock Tools 1.5.6 程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉，保存為pdbqt 格式，作為對接配體。以IL6和VEGF作為受體，以中藥候選成分作為配體，根據靶蛋白復合物中配體的坐標確定分子對接的活性位點，根據IL6和VEGF蛋白活性口袋設置Gridbox 坐標及大小，采用AutoDock Vina 進行分子對接，對對接結果進行分析處理。

2 結 果

2.1 四妙勇安湯活性成分的篩選 通過TCMSP數據庫檢索金銀花、玄參、當歸、甘草的有效成分，并與文獻中檢索得到的有效成分一同納入，初步提取出金銀花化學成分236種、玄參化學成分47種、當歸化學成分125種、甘草化學成分280種，經ADME篩選后共獲得金銀花23種、玄參9種、當歸2種、甘草93種，共127種化學成分，按OB值的大小列舉出了30個，包括哈帕苷(harpagoside)、胺(inermine)、丁子香萜(mairin)、甘草酚(glycyrol)，詳見表1。金銀花成分作用靶點395個、玄參成分作用靶點95個、當歸成分作用靶點92個、甘草成分作用靶點1 893個，合并后刪除重復值共得到靶點137個。

表1 四妙勇安湯的藥物活性成分

2.2 四妙勇安湯治療冠心病潛在作用靶點 將收集到的金銀花、玄參、當歸、甘草靶點刪除重復值后，得到四味藥有效成分作用靶點137個，冠心病靶點3 177個，將藥物與疾病的靶點合集得到藥物與疾病的Venn圖。獲得藥物與疾病的共有靶點為116個，即為四妙勇安湯治療冠心病的潛在靶點。詳見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點合集的Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點網絡圖 治療冠心病的“藥物-成分-靶點”網絡圖見圖2，圖中左上方圓圈代表藥物的作用靶點，右下方長方框代表藥物的活性成分，Degree值大于80的標記為紅色，代表此節點更重要，圖中共有262個節點，其中藥物4個，藥物治療疾病的活性成分121個，藥物的作用靶點137個，通過Cytoscape 3.7.1內置的Network Analyzer分析四妙勇安湯治療冠心病的核心成分，按Degree值進行排序：槲皮素(介度為0.260 949 55，緊密度為0.522 357 721 69，連接度為169)、β-谷甾醇(介度0.088 000 00，緊密度0.467 000 000 00，連接度為150)、山奈酚(介度為0.083 000 00，緊密度0.462 000 000 00，連接度105)，預測槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚為四妙勇安湯治療冠心病的主要活性成分。

圖2 四妙勇安湯治療冠心病的藥物活性成分靶點圖

2.4 藥物-疾病的核心靶點PPI網絡圖 將藥物金銀花、玄參、當歸、甘草與冠心病的靶點合并取交集，得到藥物治療疾病的116個靶點，將116個靶點導入STRING數據庫，物種限定為“人”，得到藥物-疾病PPI網絡圖，圖中共有116個節點、1 239條邊，平均連接度值為21.4，設置中將網絡中斷開連接的節點隱藏，詳見圖3，節點代表靶標蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關系。再將該結果以TSV格式導出，導入到Cytoscape 3.7.2軟件中，以Degree值大于平均值22為標準進行篩選，最終得到43個核心靶點，詳見圖4。其中顏色字體越大代表節點值較高的靶點，其中IL6、腫瘤壞死因子(TNF)和血管內皮生長因子A (VEGFA)可能是四妙勇安湯治療冠心病的主要靶點，TP53基因、表皮生長因子(EGF)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK8)、禽肉瘤病毒17的轉化基因(JUN)、過氧化氫酶(CAT)、環氧化酶2(PTGS2)等亦為重要的靶點。

圖3 四妙勇安湯-冠心病靶點PPI網絡圖

圖4 四妙勇安湯-冠心病核心靶點PPI網絡圖

2.5 GO生物過程分析 將藥物治療疾病的116個靶點錄入DAVID數據庫并進行GO分析，得到分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞成分(CC)條目，再根據P≤0.05、錯誤發現率(FDR)≤0.05進行篩選，得到GO-BP 47條、GO-CC 11條、GO-MF 12條。并通過在線網址omicsshare(http://omicsmart.com/)對數據進行可視化。由結果可見，多個靶點的功能與冠心病的發生發展密不可分。四妙勇安湯主要參與的生物學過程包括對藥物反應、對缺氧的反應、對一氧化氮生物合成過程的正向調控和調節老化等；相關靶點治療冠心病的功能主要富集在與轉錄因子結合、活化蛋白質異源二聚體、與同一蛋白、血紅素結合等。詳見圖5～圖7。

圖5 四妙勇安湯-疾病交集的靶點GO-BP富集分析

圖6 四妙勇安湯-疾病交集的靶點GO-CC富集分析

圖7 四妙勇安湯-疾病交集的靶點GO-MF富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 將藥物作用與疾病的靶點錄入DAVID數據庫，得到KEGG通路73條，以P≤0.05以及FDR≤0.05為篩選標準，篩選出了17條，包括癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號通路和低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路。詳見表2。

表2 四妙勇安湯治療冠心病靶點通路富集結果

2.7 四妙勇安湯中核心活性化合物作用于IL6和VEGFA的分子對接結果 結合能小于0說明化合物與蛋白可以自發結合，使用autodock vina所做的對接，結合能在-5～-10 kJ/mol表明結合效果比較好[7]，化合物與蛋白結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大。分子對接結果顯示，將四妙勇安湯在藥物化合物-靶點網絡中按Degree值選取13個核心活性化合物與IL6、VEGFA進行分子對接，與IL6結合能最低的化合物分別為豆甾醇(結合能為-7.5 kJ/mol)、木犀草素(結合能為-7.0 kJ/mol)和異鼠李素(結合能為-7.0 kJ/mol)。與VEGFA結合能最低的化合物分別為豆甾醇(結合能為-8.3 kJ/mol)、shinpterocarpin(結合能為-7.7 kJ/mol)、β-谷甾醇(結合能為-7.6 kJ/mol)和licoagrocarpin(結合能為-7.6 kJ/mol)。由結合能可見四妙勇敢湯藥物核心成分與靶分子結構穩定，結合活性較高。選取結合能較優的10個核心化合物進行展示(見表3)，分別展示了結合能最優的豆甾醇與IL6和VEGFA的3D效果(見圖8、圖9)。

表3 四妙勇安湯中結合能較優的10個核心化合物作用于IL6和VEGFA 單位： kJ/mol

圖8 豆甾醇與IL6的3D互作蛋白

圖9 豆甾醇與VEGFA的3D互作蛋白

3 討 論

冠心病是嚴重威脅人類健康的心臟疾病，現代醫學為防治冠心病制定了諸多策略，但治療過程中仍有胃腸道不適、重要臟器出血等不良反應，中醫通過辨證治療冠心病往往能取得良好的效果。臨床工作中發現，四妙勇安湯加味治療穩定型心絞痛療效確切，并能改善病人的臨床癥狀和血脂水平[8]。實驗研究發現，四妙勇安湯能不同程度地降低白細胞介素1(IL1)、TNF-α和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平的作用以及減少斑塊區NF-κBp65亞基表達[9]。

冠心病的主要病因是動脈粥樣斑塊形成，炎癥反應介導了動脈粥樣硬化形成的不同階段，從最初的白細胞募集到不穩定動脈粥樣硬化斑塊的最終破裂，一些炎癥級聯標志物[如P-選擇素、IL6、TNF-α、可溶性細胞間黏附分子-1和C-反應蛋白(CRP)]已經被證明可以預測斑塊破裂的風險[10]。現代醫學的炎癥反應與中醫的熱毒有相似之處，且冠狀動脈粥樣硬化性心臟病與脫疽均屬于血管病變，而四妙勇安湯為治療熱毒脫疽的千古名方，根據“異病同治”的治療原則，推測四妙勇安湯能夠治療冠心病，并在臨床治療中取得良好療效[11]。

本研究通過網絡藥理學方法初步篩選出四妙勇安湯治療冠心病的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚。槲皮素是天然的抗氧化劑之一，動脈粥樣硬化形成過程中低密度脂蛋白通過受損的內皮進入管壁內膜，氧化修飾成低密度脂蛋白膽固醇，研究發現槲皮素可以在體外抑制低密度脂蛋白氧化從而防治動脈粥樣硬化[12]。植物甾醇β-谷甾醇可與膽固醇競爭腸道內膽鹽膠束內的空間，從而減少膽固醇的吸收[13]，一項薈萃分析顯示，每天攝入2.15 g的甾醇可使低密度脂蛋白膽固醇降低8.8%[14]。山奈酚是一種天然的類黃酮，存在于多種植物中，研究發現，山奈酚對心臟具有保護作用，通過多種途徑實現，如抑制炎性因子TNF、 IL1、IL6和NF-κB的激活而發揮抗炎作用[15]；抑制凝血酶和纖維蛋白聚合物的形成而發揮抗血小板作用[16]；提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的濃度而起到抗氧化作用[17]。分子對接結果顯示，四妙勇安湯中豆甾醇、木犀草素和異鼠李素等與靶點VEGFA和IL6具有一定的親和力，故推測四妙勇安湯主要通過豆甾醇、木犀草素和異鼠李素來治療冠心病。

本研究通過網絡藥理學方法發現，四妙勇安湯治療冠心病的靶點主要是IL6、TNF和VEGFA。動脈粥樣斑塊的形成，巨噬細胞吞噬低密度脂蛋白后變成泡沫細胞，釋放大量的細胞因子，如IL6、TNF，這些炎性因子會促進斑塊的不穩定和導致內皮功能障礙[18]。VEGFA促進動脈粥樣斑塊內不成熟的病理性新生血管生成，動脈粥樣硬化形成過程中釋放的炎癥細胞、脂質會通過這些新生血管滲漏出來，加重炎癥反應。此外，不穩定的病理性新生血管一旦破裂會導致出血，加重管腔狹窄，增加心腦血管疾病急性發作的風險[19]。

四妙勇安湯治療冠心病的通路包括TNF信號途通路、HIF-1信號通路和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路。TNF作為一種重要的細胞因子，與其受體(TNFR1、TNFR2)結合，可以誘導細胞凋亡、細胞存活、炎癥和免疫等多種細胞內信號途徑[20]。動脈粥樣硬化時，氧氣無法彌散至內膜下組織而造成缺氧，缺氧可誘導HIF-1的激活，HIF-1α可以誘導VEGF的轉錄，促進血管生成，血管生成進一步導致斑塊體積增大和斑塊內出血，造成斑塊的不穩定[21]。PI3K可誘導下游的AKT與細胞膜相結合，并使AKT發生磷酸化，AKT激活可在體內保護心功能，防止短暫性心肌缺血損傷，縮小梗死面積[22]。由此推測四妙勇安湯主要是通過抑制TNF、HIF-1信號通路以及PI3K/AKT途徑來防治冠心病。

綜上所述，本研究顯示金銀花-玄參-當歸-甘草共有121個活性成分，作用于137個靶點，經過多種蛋白功能，涉及多種通路和生物進程，進一步體現四妙勇安湯多成分、多靶點、多途徑治療冠心病的特點，后續可以此為基礎進行實驗驗證，進一步確認四妙勇安湯治療冠心病的作用靶點和信號通路。