缺氧微環境下仙連解毒方通過調控HIF-1α影響結直腸癌細胞遷移的作用及機制研究＊

姜瑞陽 ，徐長亮 ，2，程海波 ，2＊＊，沈衛星 ，2，余成濤 ，2，譚佳妮 ，2，范旻旻 ，2

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院 南京 210023；2.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心 南京 210023）

結直腸癌（CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、死亡率高、預后差等特點[1]。在過去的十年里，由于早癌篩查、手術及治療水平的提高，CRC的存活率有所上升，但轉移性結直腸癌（Metastatic colorectal cancer）的預后較差，5年生存率在10%以下，主要由于術后復發和轉移所致[2]。因此，探究結直腸癌轉移的分子生物學機制至關重要。

在結直腸癌進展至轉移的過程中，癌細胞被認為獲得了間充質表型，使其能夠離開原發部位，侵入周圍組織，并遷移到遠端臟器組織[3]。接種后，這些細胞轉換回上皮表型并增殖形成轉移瘤，細胞在上皮和間充質表型之間轉換的過程被稱為上皮-間充質轉化（EMT）[4]。低氧是多數實體瘤微環境的特征之一，在腫瘤細胞的血管形成、治療耐藥、細胞增殖等方面至關重要[5]。缺氧誘導因子（HIF-1α）是一種控制血管生成基因表達的高度保守的轉錄因子，通過激活轉錄程序，觸發關鍵基因如血管內皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）等表達，從而促進侵襲性腫瘤表型[6-7]。HIF介導的通路被認為是缺氧誘導的EMT中最重要的通路之一，在早期的研究中，HIF-1α與肝纖維化過程中肝細胞和人臍靜脈內皮細胞中轉化生長因子β（TGF-β）的激活有關，TGF-β還可以抑制PHD2的mRNA和蛋白質表達，從而增加HIF-1α的穩定性[8-9]。此外，HIF-1α與腫瘤細胞中免疫抑制分子的表達有關，這可以通過激活TGF-β信號傳導，誘導EMT進程[10]。

國醫大師周仲瑛教授首倡癌毒病機理論，癌毒病機理論認為正氣虧虛，癌毒隨血脈流竄走注是癌癥轉移之因。因此確立“扶正培本、抗癌解毒”為惡性腫瘤的主要治法[11]，仙連解毒方是岐黃學者程海波教授基于“癌毒”病機理論創制的臨床驗方，方由仙鶴草、黃連、炙黃芪、生薏苡仁等藥物組成，具有“清熱化濕、祛瘀解毒、健脾益氣”之功。本研究旨在探究缺氧微環境下仙連解毒方對結直腸癌細胞HCT-116遷移能力的影響，并進一步探究仙連解毒方調控HIF-1α，抑制TGF-β/smad信號通路，改善EMT的可能機制，以期為仙連解毒方治療轉移性結直腸癌（Metastatic colorectal cancer）提供現代分子生物學依據。

1 材料

1.1 細胞株

人結直腸癌細胞HCT-116購自中科院上海細胞所。

1.2 藥品

仙連解毒方（仙鶴草12 g，黃連5 g，生薏苡仁30 g等）由南京中醫藥大學藥理教研室負責藥材鑒定與復方制備。以10倍和8倍體積的水煎煮兩次，每次2 h，減壓濃縮，水滴醇沉后抽濾濃縮至3 mg·mL-1，保存于-20℃備用。處理細胞前，將藥物置于4℃解凍并離心（9600r·min-1，10 min），取上清液并用0.22 μm濾膜過濾除菌。加入仙連解毒方后將培養基pH值調整至7.2-7.4。

1.3 試劑與儀器

厭氧細胞培養箱（美國Thermo公司，HERAcell 150i）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司，ECLIPSE Ti-5）；ProwerPacTM Basic 凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5500化學發光凝膠成像儀器（天能科技有限公司）。RPMI-1640培養基（上海源培生物技術有限公司，貨號：L210KJ）；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：10099-141C）；（MTT，Sigma公司，貨號：SP1080）；RIPA細胞裂解液（Biosharp公司，貨號：6503595）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，貨號：20325ES），ECL化學發光超敏顯色試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，貨號：36222）；SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II（湖南艾科瑞生物，貨號：AG11702）Evo M-MLV Mix Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物，貨號：AG11728）；過表達慢病毒構建（吉凱基因，訂單號：GXDL0244356）；Beta-Tubulin抗體（美國abcam公司，貨號：6046）、HIF-1α抗體（美國abcam公司，貨號：ab179483）、E-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：sc-8426）、N-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：sc-59987）、Vimentin抗體（美國abacm公司，貨號：ab92547）、p-Smad3抗體（美國abcam公司，貨號：ab52903）、Smad3抗體（美國CST公司，貨號：9523）。

2 方法

2.1 細胞培養

HCT-116細胞用RPMI-1640高糖培養基（培養基含10% FBS，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素）培養，將細胞置于缺氧培養箱（該培養箱內條件為95%N2和5% CO2，O2濃度維持在1%以下）中，以實現缺氧條件。

2.2 細胞轉染

取對數生長期的HCT-116細胞, 消化處理后配置細胞懸液并計數，取5×104個/孔細胞密度接種到24孔板上，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。細胞轉染前，更換孔內培養基為含HitransG P的完全培養基（1∶24的比例稀釋HitransG P），24孔板每孔500 μL。據預實驗結果以MOI=100加入病毒，孵育12 h后棄掉上層轉染液，加入含10% FBS的RPMI-1640培養基培養繼續培養。并根據細胞生長情況及時更換培養基，在培養72 h后，可在熒光顯微鏡下檢測細胞的轉染效率。

2.3 細胞形態觀察

將處于對數生長期的結腸癌細胞用胰酶消化后接種到培養皿中，待細胞貼壁后分別加入濃度為1.7 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1、6.8 mg·mL-1的 XLJDF 醇提物，置于缺氧培養箱中，孵育48 h，倒置于顯微鏡下觀察細胞形態。

2.4 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期的細胞接種于96孔板，濃度為每毫升1×104個，每孔100 μL，并設立6個復孔，待細胞貼壁后加入XLJDF醇提物置于缺氧培養箱中48 h。藥物干預結束后，每孔加入20 μL MTT（5 mg·mL-1）試劑后繼續培養3 h。反應結束后，吸取孔內培養液，加入DMSO 150 μL，用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-（藥物處理組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

2.5 傷口愈合實驗和Transwell法檢測細胞遷移能力

傷口愈合實驗：將細胞接種在6孔板中，每孔細胞數為4 × 105個，置于缺氧培養箱中培養。待細胞幾乎達到100%融合，使用10 μL槍頭在培養板底部劃線，使用PBS洗滌1-2次以去除細胞殘渣并添加不含FBS的培養基。然后在0 h、24 h和48 h的時間點觀察細胞并拍照。

Transwell實驗：在上室加入200 μL無血清培養基懸浮的細胞，數量為3×104個，下室加入600 μL含10%FBS的完全培養基。細胞在缺氧培養箱中孵育48 h。4%多聚甲醛固定后，用結晶紫染料染色。使用棉簽輕輕去除內室上的細胞。隨機選擇三個視野，使用光學顯微鏡拍照并計數。

2.6 qRT-PCR檢測基因mRNA的表達

收集HCT16細胞，TRIzol法提取樣品中的總RNA，測定RNA濃度后，使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR（AG11728，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN,Co.,Ltd）進行逆轉錄反應，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（AG11701，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN,Co.,Ltd）進行RT-PCR擴增反應。HIF-1α以betaactin為內參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α的表達。所需引物序列如下： HIF-1α F：5'-GAACGTCGAAAAGA AAAGTCTCG-3'， R：5'-CCTTATCAAGATGCGAACTC ACA-3'；β-actin F：5'-TTTGTCAACCCTCAATCCCA-3'，R：5'-GCAACACTCAGTAACCTCCCAC-3'。

2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

取對數生長期的結腸癌HCT-116細胞，在缺氧環境下予仙連解毒方干預48 h后提取包漿總蛋白。每孔上樣量為20 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（80 V），接著將蛋白轉移至 PVDF膜（200 mA，90 min），5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h。然后將膜與特異性一抗4℃孵育過夜。將膜用PBST洗滌3次，與二抗（PBST稀釋，稀釋倍數為1∶10000）室溫孵育1 h。最后用PBST洗膜3次，通過化學發光檢測蛋白質表達水平，Image J軟件進行條帶灰度值分析。

2.8 統計學分析

統計學處理使用Graph Pad Prism 8.0軟件，實驗數據以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HIF-1α在缺氧CRC細胞中高表達

圖1 HIF-1α在缺氧CRC細胞HCT-116中高表達（，n=3）

缺氧誘導因子1（HIF-1）是一種由缺氧激活的轉錄因子，HIF-1由α和β兩個亞基組成[12]，HIF-1α亞基可受氧濃度調節，其表達與缺氧程度呈正相關[13]。基于此，研究結直腸癌細胞HCT-116在常氧、缺氧條件下分別培養6 h、12 h、24 h，細胞內HIF-1α蛋白的表達情況，Western blot結果顯示，與常氧組相比，缺氧條件下細胞內HIF-1α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與缺氧干預6 h組相比，缺氧干預12 h和24 h HIF-1α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），呈時間依賴性。見圖1。

表1 仙連解毒方對缺氧CRC細胞活力的影響（，n=3）

表1 仙連解毒方對缺氧CRC細胞活力的影響（，n=3）

注：與空白對照組相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01。

組別空白時間48 h濃度/mg·mL-1 IC50/mg·mL-1仙連解毒方48 h 0 2 4 6 8 1 0 6.75±0.93 12 14 16存活率/%100±4.82 95.99±1.842）70.99±2.512）68.81±4.082）58.98±5.412）53.75±3.072）37.75±1.292）30.00±1.481）29.34±0.761）

3.2 仙連解毒方對缺氧CRC細胞活力的影響

MTT結果示：缺氧培養箱XLJDF干預48 h后，在2、4、6、8、10、12、14、16 mg·mL-1濃度下均可抑制缺氧HCT-116細胞活力（P＜0.05或P＜0.01），IC50=6.75 mg·mL-1，因此選用低、中、高濃度分別為1.7 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1、6.8 mg·mL-1進行后續實驗。見表1。

3.3 仙連解毒方對缺氧CRC細胞形態的影響

如鏡下所示：空白對照組HCT-116細胞生長良好，形態舒展，輪廓清晰規則，呈多邊形分布，細胞間有相互重疊、連接生長，密度較大。給藥后細胞形態變尖，部分細胞變圓皺縮，細胞密度降低，漂浮細胞數量增多。隨著藥物濃度的增加變化較為顯著。見圖2。

圖2 仙連解毒方對缺氧CRC細胞HCT-116細胞形態的影響

圖3 仙連解毒方對HCT-116細胞遷移的影響

3.4 仙連解毒方在體外抑制缺氧CRC細胞遷移

細胞劃痕實驗示（圖3A、3B），與對照組相比，XLJDF各濃度組干預48 h后，細胞遷移率顯著減弱（P＜0.05或P＜0.01），Transwell遷移實驗示（圖 3C、3D），與對照組相比，XLJDF給藥組細胞遷移到下室的數量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。

3.5 仙連解毒方調控CRC細胞的EMT

已有研究證明，缺氧通過HIF-1α上調E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的轉錄抑制因子，誘導EMT，促進結直腸癌的進展及轉移[14]。在此基礎上進一步研究以驗證XLJDF是否能夠通過調節HIF-1α，影響EMT進程，從而抑制CRC轉移。Western blot檢測結果顯示，與缺氧空白對照組相比，XLJDF低、中、高濃度給藥組能顯著抑制HIF-1α、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）的蛋白表達水平，升高E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達水平，（P＜0.05或P＜0.01）；XLJDF中、高劑量組能降低波形蛋白Vimentin的蛋白表達水平（P＜0.05）。這些結果表明，XLJDF抑制了CRC細胞轉移，其機制可能與抑制HIF-1α，改善缺氧微環境，逆轉EMT過程有關。見圖4。

3.6 仙連解毒方通過抑制HIF-1α的表達抑制缺氧CRC細胞遷移

3.6.1 HIF-1α過表達細胞株的構建

基因名稱：HIF1A(NM_001530)，物種：Human，載體名稱：GV358，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。載體圖譜見圖5A。RT-PCR（圖5B）和Western blot（圖5C、5D）結果顯示，與空載體組相比，HIF-1α過表達組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）。

3.6.2 XLJDF減弱HIF-1α過表達細胞的遷移能力

細胞劃痕實驗（圖5E、圖5F）和Transwell細胞遷移實驗（圖5G、圖5H）結果顯示，與空載體組相比，HIF-1α過表達組細胞傷口愈合速率和遷移到下室的細胞數顯著上調（P＜0.05），與HIF-1α過表達組對比，XLJDF+HIF-1α組細胞遷移速率和遷移到下室的細胞數均降低（P＜0.05）。提示XLJDF逆轉了上調的HIF-1α在促進HCT-116細胞遷移中的作用。

3.7 仙連解毒方對TGF-β/smad信號通路的影響

Western blot檢測結果顯示，與空白對照組相比，XLJDF各濃度干預后，HCT-116細胞內TGF-β、p-Smad3/Smad3的比值顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），XLJDF高濃度組干預后Smad3表達量降低（P＜0.05），中、低濃度組表達無明顯改變（P＞0.05）。見圖6。

圖4 缺氧微環境下仙連解毒方對EMT過程的影響

圖5 仙連解毒方通過抑制HIF-1α的表達抑制HCT-116細胞遷移

圖6 仙連解毒方對TGF-β/smad通路相關蛋白的影響

4 討論

目前，中醫對于腫瘤轉移的病機理論研究尚不成熟。郭子瑗等[15]認為三焦形質異常是腫瘤轉移的關鍵因素，張玉人[16]認為“伏毒”學說與腫瘤轉移的病機聯系緊密。腫瘤中晚期，人體臟腑功能減退，氣血陰陽失調，正氣虧虛，而癌毒日盛，突破正氣束縛，隨經絡、血脈等流竄走注，并于最虛之處停積，形成腫瘤的復發轉移。“癌毒”病機理論認為，“正氣虧虛，癌毒流注”是腫瘤轉移的基本病機，從而確立了“扶正培本，抗癌解毒”為防治腫瘤轉移的主要治法[17]。

上皮細胞通常被定義為具有分泌功能的表面屏障細胞，顯示出由粘附和緊密連接建立的不同頂端與基底外側極化。間充質細胞具有“錨定”功能，通常具有更高的“流動性”，在組織修復和傷口愈合中起重要作用。胚胎發育過程中，分化的極化上皮細胞根據細胞外信號，發生形態的改變，統稱為EMT，癌癥發展過程中的EMT促使腫瘤細胞更具侵襲性表型。在分子水平上，EMT的顯著特點是上皮細胞標志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）下調，間充質標志物如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）上調[18-19]。

缺氧是實體瘤微環境的特征之一，缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達增加是其標志之一。在正常組織中，氧分壓為通常為10-80 mmHg，而腫瘤組織中通常包含嚴重缺氧（＜0.5 mmHg）和中度缺氧（0.5-20 mmHg）的低氧濃度區域，這與腫瘤轉移、耐藥、放射抗性、不良預后密切相關[20]。缺氧可穩定誘導HIF-1α，已知HIF-1α介導TGF-β1依賴性途徑，而TGF-β是EMT的廣泛誘導劑[21]。TGF-β信號傳導在細胞形態改變、細胞增殖、細胞分化、上皮間質轉化、再生和免疫調節中發揮重要作用[22]。癌細胞來源的TGF-β可以通過觸發血管生成、上皮間質轉化和基質金屬蛋白酶（MMP）系統來促進腫瘤生長，從而促進ECM降解[23]。有文獻報道[24-25]，TGF-β信號傳導促進了促腫瘤微環境的生成，Smad3是經典TGF-β信號通路的關鍵介質，在TGF-β1介導的轉錄調控中發揮重要作用[26]。

本研究通過缺氧培養條件下的細胞實驗，探討仙連解毒方抑制結直腸癌細胞HCT-116遷移的有效性及可能機制。用MTT比色法驗證仙連解毒方醇提物對缺氧條件下HCT-116細胞活性的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。已有廣泛研究表明，缺氧誘導因子HIF-1α在缺氧CRC中高表達，本實驗驗證了結直腸癌細胞HCT-116在缺氧條件下干預6 h、12 h、24 h時細胞內HIF-1α的蛋白表達情況，缺氧組HIF-1α蛋白表達水平顯著高于常氧組，且24 h內隨時間的延長而增加（P＜0.05或P＜0.01）。傷口愈合實驗和Transwell細胞遷移實驗驗證了仙連解毒方醇提物對缺氧CRC細胞遷移能力的影響，遷移能力隨作用時間的延長而增加（P＜0.05或P＜0.01）；EMT在結直腸癌轉移中意義重大，因此推測仙連解毒方是否通過EMT過程影響缺氧CRC細胞遷移能力，通過Western blot實驗檢測EMT相關的關鍵指標——E-cadherin、N-cadherin、Vimentin，結果示缺氧條件下仙連解毒方可以逆轉EMT進程。構建HIF-1α過表達細胞株，通過Transwell細胞遷移實驗和傷口愈合實驗證實，HIF-1α過表達增強了缺氧HCT16細胞的遷移能力，接著給予XLJDF中劑量（3.4 mg·mL-1）組干預，逆轉了這一過程。缺氧條件下TGF-β/smad通路與EMT密切相關，因此用Western blot實驗檢測TGF-β/smad通路相關蛋白，結果提示仙連解毒方可以抑制TGF-β/smad信號通路。

課題組前期采用中藥復方含藥血清[27]及水滴醇沉劑[28-29]，在體外初步探討仙連解毒方的作用及機制。長期以來，中藥復方細胞實驗給藥方法在學術界存在爭議，本實驗采用水滴醇沉法給藥，也具有一定局限性。Huang等[30-31]采用含藥血清去蛋白離體方法學進行中藥復方離體實驗，減少粗制劑中金屬離子、雜質等對結果的影響，消除了氧化應激源H2O2誘導的細胞對藥物體外假陽性反應，具有廣泛借鑒意義。在后續的實驗中，我們將進一步開展實驗研究，不斷完善給藥方式，深入探討仙連解毒方抑制結直腸癌轉移的作用及機制。

綜上，XLJDF通過調控 HIF-1α，抑制 TGF-β/smad信號通路，影響EMT進程，從而在體外抑制結直腸癌細胞轉移。