黃芩對復發性流產孕鼠的安胎作用＊

馮藜櫪，姜仁建，周 杰，王 根，袁 濤

（1.重慶市長壽區人民醫院 重慶 401220；2.重慶市中醫院 重慶 400000）

復發性流產（RSA）是指處在育齡期的女性，在未改變性伴侶的情況下，與之結合受孕后，接連出現兩次以上的自然流產，并且多數發生在妊娠不超過20周時[1]。其病因至今不完全明確，主要涉及免疫、內分泌、遺傳性疾病、子宮的先天發育異常、感染、凝血功能異常等，其中最主要的因素是免疫異常[2]。母-胎界面異常炎癥反應，及其導致的免疫平衡被打破是引發胎兒丟失的重要原因。研究表明，巨噬細胞作為哺乳動物子宮內的主要免疫活性細胞，在調節子宮免疫微環境、介導炎性反應中發揮著重要作用[3]。巨噬細胞在不同的微環境影響下，可極化成M1型和M2型[4]。發生在任何時間、任何階段的巨噬細胞M1/M2型極化異常，均會導致自然流產的發生[5]。

近年來，逐年增多發生的RSA，已對生育期女性的心身健康造成了嚴重的消極影響。然而目前西醫對于治療RSA的療效有限。因此，探索效果優良的保胎中藥及治療方法具有十分重大的價值。黃芩作為傳統的保胎藥物，具有清熱涼血、安胎的作用，是歷代中醫治療血熱型的胎動不安、滑胎的常用中藥。但目前對于黃芩保胎的基礎研究，報道尚少。本研究，通過觀察在黃芩干預下，RSA孕鼠模型胎盤組織病理結構的變化，以及孕鼠胎盤組織中M1型巨噬細胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬細胞因子（Arg-1、IL-10）表達的變化；探討黃芩是否通過調節巨噬細胞M1/M2型極化，參與塑造了胎盤局部母-胎界面的免疫耐受機制，從而起到安胎作用，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物及藥品制備

由北京華阜康生物科技股份有限公司提供的SPF級小鼠，包括5只BALB/C雄鼠，10只DBA/2雄鼠，30只CBA/J雌鼠，大約8周大小，平均體質量在（20 ±2）g，許可證號SCXK（京）2019-0008；本實驗符合本單位的倫理學標準。黃芩從重慶市中醫院中藥房（重慶康美藥業股份有限公司生產，批號：210201）購得，經重慶市中醫院藥劑科冷靜教授鑒定，為唇形科植物黃芩（S.baicalensis）的干燥根。取適量的藥材黃芩，蒸餾水浸泡，回流，提取2次，過濾，濃縮定容至濃度為1 kg·L-1黃芩水提液，置-20℃冰箱保存備用。生理鹽水由重慶市中醫院購得。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素染液（批號：ZH202509，武漢塞維爾生物科技有限公司）；伊紅染液（批號：CR2011064，武漢塞維爾生物科技有限公司）；iNOS兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A14031，ABclonal）；IL-6兔多克隆抗體（濃度：1∶100，貨號：bs-0782R，北京博奧森有限公司）；TNF-α兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A0277，ABclonal）；Arg-1兔單克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A4923，ABclonal）；IL-10兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A17501，ABclonal）；透射電子顯微鏡（型號JEM-1400FLASH，日本電子（JEOL））；熒光掃描顯微鏡（P250 FLASH，丹吉爾公司）等。

2 方法

2.1 實驗動物及處理

實驗分組：空白組、RSA模型組、黃芩治療組。以國際公認的經典方法造模[6-7]，將發情的CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠按雌雄2∶1的比例合籠，使之自由交配，制造正常妊娠孕鼠模型（CBA/J×BALB/C），選取造模成功的正常妊娠孕鼠模型作為空白組；將發情的CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠按雌雄2∶1的比例合籠交配，制造復發性流產孕鼠模型（CBA/J×DBA/2），將造模成功的復發性流產孕鼠模型隨機均分為RSA模型組和黃芩治療組。合籠的第2天早晨檢查陰栓，發現明顯陰栓者為陽性，以檢出陰栓記為孕第0天。空白組和RSA模型組均自孕1天開始連續給予生理鹽水（2 mL·kg-1·d-1）灌胃；黃芩治療組自孕1天開始連續給予黃芩水提液（10 g·kg-1·d-1）灌胃，實驗藥物劑量參考常用最佳量[8]。連續灌胃2周后脫椎取材。

2.2 統計胚胎丟失率

懷孕2周后，脫椎，解剖子宮，取出胚胎，記錄胚胎吸收數、胚胎存活數，計算胚胎丟失率，胚胎丟失率=吸收胚胎數/（吸收胚胎數+存活胚胎數）。

2.3 HE染色檢測小鼠胎盤組織

處死孕鼠后，取胎盤組織，予以固定，脫水，包埋，切片，脫蠟至水，蘇木素染色，10-20 min后沖洗；1%鹽酸酒精分化，5-10 s后沖洗；氨水返藍，5-10 s、0.5%伊紅溶液染色，3-5 min后沖洗；脫水，透明，封片，光鏡下觀察。

2.4 透射電鏡觀察小鼠胎盤組織

取胎盤組織，雙重固定；脫水；滲透（比例分別為3∶1、1∶1、1∶3，每步 30-60 min）；純樹脂包埋，聚合，切片，染色，干燥；透射電鏡下觀察，圖像采集。

2.5 免疫熒光法檢測小鼠胎盤組織內iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10表達情況

取各組孕鼠胎盤組織，石蠟切片，乙醇脫蠟至水，浸泡，加熱沸騰，斷電，間隔5 min）后，反復1次，冷卻；PBS洗3次，每次5 min）；封閉，室溫30 min）；加一抗，4℃過夜；PBS洗 3次，每次 5 min）；加二抗，37℃30 min）；滴加DAPI，室溫孵育10 min）；PBS洗3次，每次5 min）；封片。攝取圖片，Image J圖像分析。

3 統計學分析

實驗數據應用SPSS21.0 統計分析軟件對采集的數據進行單因素方差分析，統計結果用均數 ± 標準差（）表示，P＜ 0.05認為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 各組胚胎丟失率比較

與空白組相比，RSA模型組胚胎丟失率明顯上升，差異具統計學意義（P＜ 0.05）；與RSA模型組相比，黃芩治療組胚胎丟失率明顯降低，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）（表1）。

4.2 各組孕鼠胎盤局部的病理形態改變

HE染色，空白組胎盤組織的蛻膜帶、巨細胞滋養層、海綿滋養層結構正常；與空白組對比，RSA模型組胎盤組織可見蛻膜帶局部脫落，巨細胞滋養層壞死，數量減少，海綿滋養層局灶性壞死，且出現了大量炎性細胞浸潤；與RSA模型組相比，黃芩治療組胎盤組織各層次結構較清晰，僅見海綿滋養層點狀壞死，伴有少量炎性細胞浸潤，其他結構未發現明顯病理改變（表2、圖1）。

表1 各組胚胎丟失率比較（n = 5）

表2 小鼠胎盤組織HE染色結果

圖1 小鼠胎盤病理形態學變化（HE，×400）

圖2 透射電鏡下各組小鼠胎盤組織超微結構的變化（×8000-15000）

4.3 各組孕鼠胎盤組織TEM檢查結果

TEM下觀察各組孕鼠胎盤組織超微結構，空白組胎盤組織的合體滋養層和細胞滋養層形態結構正常；與空白組相比，RSA模型組胎盤形態結構明顯異常，合體滋養層細胞疑似發生壞死，細胞核顯著皺縮，染色質聚集，電子密度增大，胞漿內線粒體出現腫脹，粗面內質網高度擴張；細胞滋養層細胞疑似壞死；與RSA模型組相比，黃芩治療組胎盤合體滋養層和細胞滋養層未發現明顯異常（圖2）。

表3 小鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α平均熒光強度統計結果（，n = 9）

表3 小鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α平均熒光強度統計結果（，n = 9）

注：與空白組相比，*P ＜ 0.05；與RSA模型組相比，#P ＜ 0.05。

TNF-α 14.0863 ± 0.7658 18.6611 ± 0.6323*15.7321 ± 0.4751#組別空白組RSA模型組黃芩治療組iNOS 15.5444 ± 0.7089 21.7309 ± 0.6233*16.2032 ± 1.0056#IL-6 12.2734 ± 0.3700 19.0583 ± 0.5200*12.9359 ± 0.3518#

4.4 免疫熒光法檢測各組孕鼠胎盤組織中iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10的表達

由表3、4及圖3、4結果顯示，與空白組相比，RSA模型組孕鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α表達均明顯增高，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表達均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。與RSA模型組相比，黃芩治療組孕鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α表達均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表達均明顯增高，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）（表3、表4、圖3、圖4）。

表4 小鼠胎盤組織Arg-1、IL-10平均熒光強度統計結果（，n = 9）

表4 小鼠胎盤組織Arg-1、IL-10平均熒光強度統計結果（，n = 9）

注：與空白組相比，*P ＜ 0.05；與RSA模型組相比，#P ＜ 0.05。

IL-10 26.6663 ± 0.3907 19.8832 ± 0.5709*25.7617 ± 0.4433#組別空白組RSA模型組黃芩治療組Arg-1 25.8579 ± 0.3656 18.9046 ± 0.2731*24.9819 ± 0.4823#

圖3 各組胎盤組織中iNOS、IL-6、TNF-α的免疫熒光表達（×400）

圖4 各組胎盤組織中Arg-1、IL-10的免疫熒光表達（×400）

5 結論

正常妊娠依賴于母-胎界面的各類系統在免疫微環境中精準的動態穩定。任何不良因素作用于母-胎界面，誘發其免疫微環境發生異變，都有可能導致胎兒丟失[9]。簡言之，母-胎界面免疫微環境的平衡穩定，在維持正常胚胎發育過程中起著決定性作用，是防治RSA的關節環節。

目前，西醫方面對于RSA尚無特效治療的藥物，常規治療方案多以外源性補充孕激素，如地屈孕酮、黃體酮，針對黃體功能不全的患者，這類藥物保胎療效顯著，但對其他因素引起的反復的先兆流產療效較差。所以，中醫藥在治療此病方面，具有不可忽視的潛在價值。RSA在祖國傳統醫學里屬“滑胎”、“胎動不安”之列，該病的病因主要在先天胎元不固與后天氣血不調兩個方面。腎為先天之根本，主天癸，先天腎氣腎精充盛，則胎兒有所育；脾為后天之根本，脾氣充實，則氣血化生有源，使胎兒有所養。因此，中醫理論多以補腎健脾為安胎基本療法，目前對于安胎的中醫藥研究多集中在健脾益腎方面[10-11]。但在臨床實踐中，證候之虛、實、寒、熱不同，當根據不同辨證而論治。女子懷孕之后，氣血聚集沖任，以養育胎元，若素體肝氣旺盛，再遇情志不遂，或素體陽氣偏亢，則易郁生內熱，熱擾胞宮，血為熱迫而不循常道，氣血不調，也可致胎動不安。因此，臨床辯證為“血熱”者，當調節沖任之氣血，清熱以安胎。黃芩最開始記錄于《本經》，為唇形科植物黃芩的干燥根，朱震亨將其稱作“安胎圣藥”[12]，其性涼味苦、寒，擅于清熱、瀉火、止血、安胎[13]。臨床滑胎時辯證為血熱者，中藥湯劑中常配伍黃芩以清熱安胎[14]。因此，本研究選用黃芩干預RSA孕鼠，研究其清熱安胎的可能作用機制，為中醫臨床辨證論治以安胎提供相應的理論支持。

自1980年研究發現，雌性CBA/J小鼠（H-2K）與雄性DBA/2小鼠（H-2d）交配后，具有易患反復自然流產的特點,孕鼠流產率高達20%-45%，而在同為H-2K×H-2d交配方式的CBA/J×BALB/C中，孕鼠的流產率僅為5%-10%，這個發現為深入研究妊娠這一復雜生理現象提供了兩個經典的動物模型，即CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型，將CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立復發性流產模型，這一造模方法是目前國際公認的經典造模方法[6-7]，被廣泛用于RSA相關實驗研究[15-17]。因此，本實驗以目前國際公認的經典造模方法制造了正常妊娠模型和復發性流產模型。

本研究發現，黃芩治療組胚胎丟失率明顯低于RSA模型組，表明黃芩有利于降低RSA孕鼠自然流產風險。本實驗選用光鏡觀察了RSA孕鼠胎盤組織在細胞層面的結構，可見造模成功的RSA孕鼠胎盤組織出現了蛻膜帶的部分脫落，巨細胞滋養層和海綿滋養層也出現了不同程度的壞死，可見壞死細胞胞核固縮、崩解，胞漿滲出，以及大量的炎性細胞浸潤，這些細胞層面結構的病理改變促使了流產的發生。而經過黃芩干預治療后，可見脫落的蛻膜恢復正常，出現壞死的巨細胞滋養層和海綿滋養層被修復至僅存在點狀壞死，炎性細胞大大減少，說明黃芩具有明顯改善RSA孕鼠胎盤組織顯微結構的作用。且本實驗進一步運用了放大倍數大于光鏡1000倍的透射電鏡觀察各組孕鼠胎盤的絨毛超微結構，包括其表面的合體滋養層和軸心的細胞滋養層，可見RSA模型孕鼠的合體滋養層細胞和細胞滋養層細胞疑似發生壞死，其胞內結構發生了明顯異常改變，出現了細胞核顯著皺縮，染色質聚集，電子密度增大，胞漿內線粒體大量腫脹，粗面內質網高度擴張；而經黃芩干預后的RSA胎盤絨毛超微結構幾乎與正常孕鼠相同，說明黃芩可有效改善RSA孕鼠模型胎盤局部的超微結構病變。綜上所述，黃芩可明顯修復RSA孕鼠胎盤局部母-胎界面的異常病理改變。

本實驗層層推進，從免疫層面入手，進一步探索了黃芩改善RSA孕鼠胎盤局部母-胎界面病理結構的可能作用機制。妊娠期間，巨噬細胞、T淋巴細胞、及自然殺傷細胞是調控子宮局部胎盤組織免疫功能的主要免疫細胞[3]。目前，對母-胎界面免疫耐受的研究，多集中在輔助T淋巴細胞Thl/Th2型細胞因子[18-19]，而對巨噬細胞相關研究較少。但在母-胎界面的免疫耐受形成過程中，巨噬細胞同樣扮演著不可忽視的角色[20]。巨噬細胞可極化為M1型和M2型，M1型巨噬細胞高表達iNOS及大量的促炎細胞因子如IL-6、TNF-α等表面特異性標記物，M2型巨噬細胞高表達Arg-1及大量的抗炎細胞因子如IL-10等表面特異性標記物[21]。有研究表示，正常妊娠蛻膜中的巨噬細胞，M2型明顯多于M1型；而RSA患者蛻膜中的巨噬細胞則以M1型占優勢[22]。徐春芳等[23]發現復發性流產病理妊娠狀態下，母-胎界面存在不同程度的M1/M2型巨噬細胞極化失衡。由此可見，M1/M2型巨噬細胞極化是否正常，直接影響母-胎界面促炎因子及抑炎因子的含量，關乎妊娠的成敗。抑制巨噬細胞M1型極化或促進M2型極化是調節-胎界面異常炎癥反應的重要方法，可有效抑制流產的發生。因此，本實驗選擇M1型巨噬細胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬細胞因子（Arg-1、IL-10）為檢測指標，以M1/M2型巨噬細胞極化平衡作為研究切入點，探究黃芩對RSA孕鼠胎盤組織局部母-胎界面M1/M2型巨噬細胞極化平衡的影響。

多項研究表明，黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，可在多種疾病中發揮抗炎作用，如在心肌炎和口腔炎中，黃芩苷通過抑制IL-6和TNF-α的表達，以達到明顯的消炎目的[24-25]。在脊髓損傷中，黃芩苷可通過抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織中M1型巨噬細胞標記蛋白iNOS和M1型巨噬細胞炎癥因子（IL-12和TNF-α）的表達，促進M2型巨噬細胞標記蛋白Arg1和M2型巨噬細胞炎癥因子（IL-4和IL-10）的表達，參與抑制脊髓損傷大鼠炎癥反應過程[26]。

本研究可見，RSA模型組過表達iNOS、IL-6、TNF-α，低表達Arg-1、IL-10，提示RSA孕鼠胎盤局部出現了巨噬細胞向M1型傾斜，為炎癥的發生發展創造了條件，而經黃芩干預后的RSA孕鼠胎盤局部可見過量表達的iNOS、IL-6、TNF-α明顯降低，Arg-1、IL-10表達明顯增高，說明黃芩可明顯抑制M1型巨噬細胞極化，促進M2型巨噬細胞極化，抑制胎盤局部母-胎界面異常的炎癥反應。

黃芩是中醫臨床常用清熱安胎藥物，功效顯著、毒副作用小、價格低廉，廣泛應用于保胎治療。本研究結果顯示，黃芩可通過調控M1/M2型巨噬細胞極化平衡，調節RSA胎盤局部母-胎界面異常炎癥反應，明顯優化RSA胎盤組織免疫微環境，改善其母-胎界面微觀結構病變，對維持妊娠起到積極作用。