健脾化瘀解毒方調控AKT/p38蛋白磷酸化改善胃癌前病變小鼠脾虛證研究＊

李思怡 ，麥偉柵 ，林琨洋 ，林澤龍 ，羅敏怡 ，潘華峰 ＊＊

（1.廣州中醫藥大學國際中醫藥轉化醫學研究所 廣州 510006；2.教育部中醫藥防治腫瘤轉化醫學研究國際聯合實驗室 廣州 510006；3.深圳大學體育學院 深圳 518000；4.廣州中醫藥大學科技創新中心 廣州 510006；5.南方醫科大學中醫藥學院 廣州 510515）

胃癌是常見惡性腫瘤之一[1]，在我國，胃癌的發生率和死亡率高居惡性腫瘤第二位[2]。胃癌前病變（Gastric precancerous lesions，GPL）是慢性胃炎演變成胃癌的關鍵環節，是指胃黏膜萎縮基礎上合并異型增生的病理改變[3]，該病理階段包含不同程度的胃黏膜損傷，臨床以胃脘疼痛、飽脹、痞悶、噯氣、納呆等為主要表現，屬中醫“痞滿”、“胃痞”以及“虛痞”等范疇。但研究表明，GPL表現為細胞退化變性和增殖長期共存，但具有一定的可逆性[4-6]。GPL常由慢性萎縮性胃炎發展而來，大量研究證實，脾虛是慢性萎縮性胃炎和GPL的發病基礎[7]。中醫理論認為GPL的病位在脾胃，基本病機是本虛標實，即“脾虛、血瘀、夾毒”[8]。有研究發現，脾虛證大鼠胃黏膜萎縮變薄，免疫功能低下及黏膜微血管新生等結構改變，病理切片可見胃黏膜固有腺體萎縮，常伴腸上皮化生以及異型增生等[9]。目前西醫對GPL主要為對癥支持治療，而中醫對于GPL治療多從“虛”和“瘀”論治[10]。《慢性胃炎中醫診療專家共識意見》認為GPL以氣陰兩虛和氣滯血瘀多見[11]。中醫辨證論治不僅可明顯改善GPL臨床癥狀，具有明顯的“既病防變”作用，在抑制或逆轉腸上皮化生及異型增生方面取得了良好的療效[9]。

課題組前期通過網絡藥理學研究表明，健脾化瘀解毒方可能通過白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等核心治療靶點，作用于 PI3K-AKT（PI3K：Phosphatidylinositide 3-kinases；AKT：又 稱 PKB（protein kinase B））、HIF-1（Hypoxia inducible factor 1）及 MAPK（Mitogen-activated protein kinase）等信號通路，發揮防治胃癌前病變的作用[2]。另外，健脾化瘀解毒方源自于四君子湯，以“健脾益氣，化瘀解毒”立法，是課題組長期臨床治療慢性萎縮性胃炎-GPL的經驗方，前期研究證實健脾化瘀解毒方能顯著改善GPL患者的臨床癥狀、內鏡表現以及病理學改變，具有明確的臨床療效[13]。缺少參考文獻序號12，請核實并修改。參考文獻需按照在正文中出現的順序依次標號，請全文核實并修改。

課題組前期研究發現，健脾化瘀解毒方可抑制SPF級同窩野生型小鼠和Atp4a-/-小鼠PI3K/AKT/HIF-1α信號通路的激活，抑制細胞惡性增殖與腸上皮化生，進而發揮修復受損胃黏膜的作用[7]，但其對于胃癌前病變小鼠脾虛癥狀的改善作用及潛在機制尚不明確。有研究說明，中醫“四季脾旺不受邪”所涵蓋的內容包括西醫脾臟、胃腸道等器官的免疫功能[8]，說明對脾臟、胃腸道等器官的觀察可能進一步反映中醫“脾”的功能。

因此，本研究基于AKT、p38蛋白磷酸化調控氧化應激理論，通過構建胃癌前病變小鼠脾虛證模型，探索了健脾化瘀解毒方治療胃癌前病變脾虛證的作用機制，豐富了中醫藥治療胃癌前病變的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體質量（20±2）g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002，動物生產許可證號SCXK（粵）2018-0034）。飼養環境：廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF動物實驗室，本實驗過程中對小鼠的處理已獲得廣州中醫藥大學動物倫理委員會同意。

1.2 儀器

JJ3000動物電子秤（公司）、自動真空組織脫水機（Leica公司）、石蠟包埋機（Leica公司）、RM2135石蠟切片機（Leica公司）、正置光學顯微鏡（日本尼康公司）、3K30離心機（SIGMA公司產品）、垂直電泳儀（美國伯樂公司）以及蛋白凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.3 藥物與試劑

健脾化瘀解毒方（黃芪20 g，太子參15 g，白術10 g，茯苓 12 g，三七粉 3 g，莪術 10 g，白花蛇舌草15 g，猴菇菌提取物15 g）；N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）（日本東京株氏會社）；無水乙醇、甲醇、二甲苯、鹽酸及中性樹脂（國藥集團化學試劑有限公司）；石蠟（Leica公司）；蘇木素、伊紅染色試劑盒（南京建成）；GAPDH兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國）；p-p38、P38、p-AKT、AKT兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國）；HRP標記的抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology，美國）；HRP標記的抗鼠IgG二抗（Cell Signaling Technology，美國）。

2 方法

2.1 造模方法

本實驗通過使用對致癌因子敏感的C57近交系小鼠BALB/c自由飲用MNNG復制GPL脾虛證小鼠模型。取50只健康SPF級雄性成年BALB/c小鼠，適應性喂養1周后，記錄體質量變化，并進行適應性飲用MNNG溶液，將體質量差異較大的小鼠淘汰，留取40只小鼠，通過隨機數表法將其分為空白組（n=8）、模型組（n=8）、健脾化瘀解毒方低劑量組（n=8）、健脾化瘀解毒方高劑量組（n=8）、陽性藥組（n=8），連續造模14周。

2.2 干預方法

SPF級4周齡，雄性，體質量20-22 g的BALB/c小鼠共40只，分為正常組（8只）及造模組（32只），模型組8只，維生素B12組8只，健脾化瘀解毒方高低劑量組各8只。正常組小鼠予正常飲食，造模組通過MNNG自由飲用復制GPL脾虛證小鼠模型，連續造模14周，造模劑MNNG飲用濃度為150 μg·mL-1。并于造模第6周聯合灌胃給藥，健脾化瘀解毒方低（MNNG+JPHYJD 3.75 g·kg-1·d-1）、高劑量組（MNNG+JPHYJD 15 g·kg-1·d-1），每日給藥1次，持續給藥8周。正常對照組和模型組以等量蒸餾水灌胃。并于末次給藥前12 h開始禁食（不禁水），取血后取材。

2.3 觀察指標

2.3.1 小鼠整體情況觀察

定期記錄小鼠的體質量及攝食情況，觀察各小鼠的體質量及攝食變化。

2.3.2 臟器指數

臟器指數為動物臟器與其體質量的比值，脾臟和胸腺作為重要的免疫器官，脾臟指數和胸腺指數對了解小鼠免疫功能有重要意義。取材時，分離小鼠的脾臟和胸腺，稱重并記錄。脾臟指數（mg/g）=脾臟重量（mg）/小鼠體質量（g），胸腺指數（mg/g）=胸腺重量（mg）/小鼠體質量（g）。

2.3.3 脾臟的病理形態觀察

在脾臟取0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，固定后用純水沖洗、修剪后放入自動脫水機進行脫水透明，脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇分別浸泡2 h和二甲苯（2道透明各30 min），石蠟包埋、切片，然后進行染色。按脫蠟、梯度乙醇復水、蘇木素和伊紅染色、梯度乙醇脫水、透明、封固的順序完成HE染色后，置于顯微鏡下觀察脾臟組織結構。

2.3.4 小鼠胃黏膜組織AKT信號通路相關蛋白與基因的表達

Western blot法檢測小鼠胃黏膜上皮細胞p-p38、p38、AKT以及p-AKT等蛋白的表達水平。

2.4 統計方法

運用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料用平均數±標準差（）表示，多組間比較采用 one-way ANOVA，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計意義，應用GraphPad 9.0軟件作圖。

3 實驗結果

3.1 體質量增長與攝食變化

每組小鼠體質量在14周后均有明顯增長，其中體質量增加最多的是空白組，模型組的小鼠體質量增長明顯低于正常組（P＜0.001）。通過健脾化瘀解毒方及陽性藥干預后，各組小鼠體質量增長出現增多趨勢，實驗結束時，健脾化瘀解毒方高劑量組及陽性藥組小鼠體質量增長顯著高于模型組小鼠（P＜0.01）。這初步提示健脾化瘀解毒方可改善MNNG所誘導的脾虛證小鼠體質量增長緩慢和攝食功能減弱，發揮改善小鼠脾虛癥狀的作用。請正文合適的位置補充見圖1。

3.2 臟器指數

圖1 各組小鼠體質量增長與攝食變化對比

圖2 各組小鼠臟器指數對比

圖3 空白組脾臟組織

圖4 模型組脾臟組織

實驗結束時，模型組的脾臟指數明顯低于空白組（P＜0.05），健脾化瘀解毒方高劑量組和陽性藥組的脾臟指數均高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。在胸腺指數方面，各組之間胸腺指數無統計學差異。這提示MNNG誘導胃癌前病變脾虛證小鼠，對其脾臟功能可能具有影響，進而促進脾虛癥狀加重，而健脾化瘀解毒方可能對脾臟功能具有保護作用。

3.3 脾臟組織病理形態觀察

如圖所示，空白組小鼠脾臟組織小梁明顯，白髓和紅髓的邊界清晰，白髓內淋巴細胞豐富，見圖3；而模型組小鼠脾臟組織紅白髓無明顯邊界，小梁消失，可見血竇出血明顯，淋巴細胞數量顯著減少，提示脾臟功能減弱，但未出現不可逆器質性病變，見圖4。與模型組相比，健脾化瘀解毒方低劑量組白髓、紅髓邊界比較清晰，血竇出血較模型組少，淋巴細胞增生，見圖5；健脾化瘀解毒方高劑量組和陽性藥組邊界清晰，淋巴細胞明顯增多，血竇出血明顯減少，提示健脾化瘀解毒方可能對脾虛證小鼠脾臟組織修復具有促進作用，見圖6、7。

圖5 健脾化瘀解毒方低劑量組脾臟組織

圖6 健脾化瘀解毒方高劑量組脾臟組織

圖7 陽性藥組

圖8 胃黏膜p-p38、p38、p-AKT、AKT蛋白表達結果

3.4 胃黏膜p-p38、p38、p-AKT、AKT蛋白表達結果

與空白組相比，模型組的p-p38、p-AKT灰度顯著高于空白組，p-p38、p-AKT表達量明顯增多，p38及AKT蛋白表達量未見明顯變化，模型組p-p38/p38及p-AKT/AKT灰度比值均顯著高于空白組，提示p38及AKT發生了磷酸化。與模型組相比，健脾化瘀解毒方高低劑量組及陽性藥組p38及AKT蛋白磷酸化程度降低，高劑量組和陽性藥組的表達量降低更明顯，與空白組的表達量相似。提示健脾化瘀解毒方可能通過抑制p38及AKT發生磷酸化，進而抑制AKT/p38信號通路。

4 討論

課題組前期運用BALB/c小鼠自由飲用復制GPL小鼠模型，可見小鼠胃黏膜出現萎縮，伴有腸上皮化生及異型增生，而健脾化瘀解毒方可明顯改善該動物模型的胃黏膜病理組織惡變[14]。在此基礎上，本研究通過對其進行脾虛證評價、以方測證及顯效機制探討，發現該模型伴有脾虛證候表現，同時以脾臟功能變化引起機體免疫功能變化，進一步闡明了健脾化瘀解毒方改善脾虛證GPL的分子生物學機制。

4.1 構建GPL-脾虛證病證結合小鼠模型

本研究通過觀察GPL小鼠的體質量及攝食情況，發現該GPL小鼠模型具有體質量增長緩慢、攝食減少表現，符合《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》中對脾氣虛證主癥為食少納呆的表現[15]。脾臟與胸腺器官相對質量的變化，取決于其中淋巴細胞增殖的程度，可反應機體免疫功能。研究發現，具有健脾功效的中藥可通過增強機體免疫功能，達到治療脾虛的作用，其顯效機制可能通過調節消化系統吸收作用[16]。因此，本研究檢測該模型小鼠脾臟及胸腺指數、HE染色結合光鏡下觀察脾臟病理組織結構，進一步發現該GPL小鼠模型伴有脾臟指數降低、脾臟病理組織結構改變，提示該GPL小鼠模型脾臟功能也出現下降。另一方面，該小鼠模型胸腺指數變化不具有統計學意義，提示該模型變化可能與胸腺引起的免疫功能下降無關，脾臟引起的免疫功能可能參與該GPL小鼠脾虛證發生。通過以上方法，對GPL-脾虛證進行初步評價，構建了GPL-脾虛證的病證結合模型。

4.2 健脾化瘀解毒方對GPL脾氣虛證具有顯著療效

在模型構建成功的基礎上，通過健脾化瘀解毒方干預，進一步發現健脾化瘀解毒方可明顯改善該GPL小鼠模型體質量增長緩慢、攝食減少情況，并在一定程度上，可提高MNNG誘導所引起的脾臟指數下降，改善其誘導的脾臟病理組織結構紊亂。方中君藥黃芪為健脾益氣代表藥，臣以太子參益氣生津、健脾滋陰的太子參，同時助長黃芪補中益氣，佐以健脾化濕的白術、茯苓，配合行氣消食的猴頭菇，佐以三七粉、莪術活血化瘀，再益以解毒抑癌的白花蛇舌草，此五藥相合，既能補脾氣、振脾陽，又能補胃氣、養胃陰[3]。全方以胃癌前病變的共同證型基礎——脾虛證為核心，發揮健脾益氣為主、活血化瘀解毒為輔的作用，從而發揮改善該GPL小鼠模型脾虛證及脾臟指數、病理組織結構的作用。

4.3 健脾化瘀解毒方通過抑制p-38/AKT改善GPL脾虛證

AKT是對調控細胞生長、增殖、存活及代謝有重要作用的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，PI3K激活后與AKT的PH結構域相互識別，導致AKT發生轉移和構象改變，進而通過磷酸化的方式調控下游信號分子，可見AKT是PI3K/AKT/mTOR信號通路的核心蛋白[17]。p38MAPK是MAPK超家族成員的重要組成部分，其可受氧化應激激活，磷酸化成為p-p38MAPK，發揮其生物學活性[18]。p-AKT、p-p38可以通過激活下游細胞受體或效應器來調節細胞的增殖、細胞凋亡、血管生成和細胞周期等[7]，AKT和p38的活化都與腫瘤的發生發展密切相關[13]，而且與多種腫瘤患者預后差密切相關[19-22]。課題組前期研究發現，健脾化瘀解毒方可抑制Atp4a-/-小鼠PI3K/AKT/HIF-1α信號通路的激活，進而發揮修復受損胃黏膜的作用[7]。本研究發現健脾化瘀解毒方可能通過抑制AKT及p38的磷酸化，調控p38/AKT信號通路。因此，健脾化瘀解毒方調控該通路，發揮對改善消瘦、攝食減少等GPL小鼠脾虛癥狀及脾臟病理組織結構的作用，進而促進受損胃黏膜的修復，可能與AKT及p38的磷酸化相關。

本研究通過構建GPL小鼠模型，結合脾虛證候分析，初步建立胃癌前病變小鼠的脾虛證病證結合評價體系，為篩選GPL脾虛證特色中藥新藥提供了載體，并結合以方測證法，明確了健脾化瘀解毒方對脾虛證GPL的療效，初步探討了p-38/AKT信號通路激活與脾虛證的關系，豐富了健脾化瘀解毒方治療GPL的理論依據，從脾虛證角度，以p38/AKT的磷酸化為切入點，為研究GPL病證結合及闡明中藥復方顯效機制提供了思路。