PTK7基因在腦膠質瘤中表達和臨床預后的生物信息數據集分析*

林藝，王策，康勛，康莊，陳峰，江波，李文斌

100070北京，首都醫科大學附屬北京天壇醫院 腫瘤綜合治療中心

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤之一，手術、放療、化療是目前腦膠質瘤的綜合治療模式[1]。腦膠質瘤患者在接受規范治療后臨床預后差異較大，臨床醫生希望在現有整合診斷基礎上尋找相關分子標志物，提高腦膠質瘤診治水平。除了Oncomine、TCGA、cBioPortal for Cancer Genomics和GEO等數據庫，CGGA已實現數據公開，為學者從事神經腫瘤領域相關的標志物研究提供了新的途徑[2-3]。PTK7隸屬于蛋白激酶家族，因最早在結腸癌中被發現，故又被稱為CCK-4[4]。其由具有類似免疫球蛋白胞外結構域、跨膜結構域和C端類激酶結構域構成。PTK7基因存在組織特異性，在多種腫瘤中表達水平升高，其高表達提示預后不佳，相關研究報道見于胃癌[5]、結直腸腫瘤[6]、乳腺癌[7]、卵巢癌[8]等。而在子宮頸癌[9]、脂肪肉瘤[10]、血液腫瘤[11]中 ，PTK7呈現為低表達， 低表達提示生存預后差。腦膠質瘤中PTK7的表達情況和預后價值尚不明確，本研究通過對TCGA、cBioPortal和CGGA等公共數據庫的檢索，分析PTK7在腦膠質瘤中的表達并研究其與臨床病理參數及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 資料數據來源

所有數據來源于互聯網開放的數據庫和分析工具，包括Human Protein Atlas，Oncomine，GEPIA，STRING，cBioPortal for Cancer Genomics和CGGA(表1)。采用Human Protein Atlas基于RNA深度測序結果分析17種常見腫瘤組織中的基因 mRNA表達情況。Oncomine平臺用于分析比較腦膠質瘤和對照組織中的基因mRNA表達水平，這共包括5項腦腫瘤數據，其中2項是膠質瘤。cBioPortal for Cancer Genomics共有11項腦膠質瘤研究，涵蓋低級別膠質瘤、膠質母細胞瘤等病例。GEPIA分析來自TCGA和GTEx項目的676個腫瘤和對照正常樣品的RNA測序表達數據。CGGA分析來自325例腦膠質瘤病例的測序數據。

表1 生物信息分析相關數據庫

1.2 數據資料挖掘

以“PTK7”為關鍵詞進行檢索，利用Human Protein Atlas 數據庫RNA-Seq數據分析PTK7基因mRNA在常見腫瘤組織中的表達水平；檢索Oncomine數據庫，分析PTK7mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達，利用CGGA分析其mRNA在腦膠質瘤中的表達。基于cBioPortal for Cancer Genomics，分析PTK7在腦膠質瘤中基因突變及拷貝數變異情況。然后，利用CGGA mRNA芯片數據庫分析PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質瘤相關臨床參數和預后的關系。再通過GEPIA獲取所有TCGA腦膠質瘤數據，選擇Group Cutoff為Median，設定高表達人群和低表達人群(Cutoff-High=50%；Cutoff-Low=50%)，驗證PTK7基因mRNA在腦膠質瘤中的表達水平，分析其與預后的關系。最后，利用STRING 構建蛋白質相互作用(protein protein interaction，PPI)網絡，尋找蛋白質之間的相互作用關系。PPI的相關基因進行GO和KEGG信號富集分析。

1.3 統計學分析

應用R 4.0.2軟件進行統計分析，采用配對t檢驗比較癌組織和癌旁組織PTK7基因的表達量差異。在GO通路富集分析中，數據間差異比較采用方差分析。KEGG富集分析中選擇的具有統計學意義的通路(P<0.05)。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank檢驗，P<0．05為差異有統計學意義。癌組織和癌旁組織表達量差異采用配對t檢驗用來比較，卡方檢驗比較臨床病理參數組間差異(n<5時行連續校正卡方檢驗)。

2 結 果

2.1 PTK7基因mRNA在泛癌組織中的表達

基于Human Protein Atlas數據庫RNA-Seq數據，研究分析了PTK7基因mRNA在多種類型腫瘤組織中的表達。共納入7 392個病例樣本(表2)：子宮內膜癌(n=541)、睪丸癌(n=134)、頭頸癌(n=499)、肺癌(n=994)、卵巢癌(n=373)、宮頸癌(n=291)、乳腺癌(n=1 075)、前列腺癌(n=494)、胰腺癌(n=176)、尿路上皮癌(n=406)、甲狀腺癌(n=501)、黑色素瘤(n=102)、結直腸癌(n=597)、腦膠質瘤(n=153)、胃癌(n=345)、腎癌(n=877)和肝癌(n=365)。PTK7基因的mRNA表達水平在子宮內膜癌、睪丸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、尿路上皮癌和甲狀腺癌中相對較高，而在黑色素瘤、大腸癌、胃癌和腦膠質瘤中表達中等。在腎癌、肝癌中，其表達水平相對較低(圖1)。

表2 PTK7基因 mRNA在泛癌組織中的表達

圖1 Human Protein Atlas 數據庫中PTK7基因 mRNA在腫瘤組織中的表達

2.2 PTK7基因mRNA在腦膠質瘤和對照組織中的表達

Oncomine表達譜芯片分析結果示，與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在腦膠質瘤組織(膠質母細胞瘤)表達較高，二者之間的差異有統計學意義(P<0.001)，Fold change值為8.245(圖2)。基于TCGA數據的GEPIA分析顯示，與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在低級別腦膠質瘤組織中表達較高(P<0.001)，二者間的差異有統計學意義；同樣與對照的正常腦組織相比，PTK7基因mRNA在腦膠質母細胞瘤組織中表達較高(P<0.001)，二者間的差異有統計學意義。CGGA數據分析結果示PTK7基因mRNA表達在II、III和IV級腦膠質瘤組織組織間差異有統計學意義(P<0.001)，表達水平隨著腦膠質瘤分級升高而升高。

圖2 PTK7 mRNA在組織中的表達

2.3 PTK7基因突變及甲基化分析

基于cBioPortal for Cancer Genomics數據庫分析，共納入11個研究數據，共計5 386例腦膠質瘤病例，結果顯示PTK7在腦膠質瘤中存在突變和擴增。PTK7基因突變率最高0.84%，擴增率最高0.58%，沒有檢測到基因融合(圖3)。甲基化分析共有源自2個研究的325例樣本檢測數據被納入，結果顯示PTK7甲基化和PTK7基因mRNA在腦膠質瘤組織中的表達呈負相關(P<0.001，圖4)，這提示PTK7基因的表達可能受到了表觀遺傳學調控。7例病例檢測到了PTK7基因拷貝數擴增，25例檢測到了PTK7基因拷貝數的輕度丟失(圖4)。按照病理類型進行分析，結果顯示42例腦膠質母細胞瘤(占比97.67%)PTK7基因甲基化水平較低(圖4)。

圖3 PTK7基因在腦膠質瘤中的突變和擴增

圖4 PTK7基因在腦膠質瘤組織中甲基化情況

2.4 PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質瘤患者臨床病理特征的關系

為進一步探討PTK7mRNA表達情況與臨床病理參數關系，研究進一步利用 CGGA mRNA芯片數據庫進行相關性分析。該數據包括病例325例腦膠質瘤病例，涵蓋不同WHO分級，PTK7的高低表達 cut-off值為13.1，高于cut-off值即高表達，反之為低表達。分析結果顯示：PTK7基因在腫瘤不同分級間(WHO II、WHO III、WHO IV)的表達差異有統計學意義(P<0.001)， 在異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)不同狀態間(野生型，突變型)差異有統計學意義 (P<0.001)， 在不同腫瘤發生類型間差異有統計學意義(P=0.004)， 在不同病理類型間差異有統計學意義(P<0.001)。PTK7表達與WHO分級、IDH狀態、腫瘤發生類型和病理類型相關(表3)。

表3 PTK7 表達與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系

2.5 PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質瘤預后的關系

為分析PTK7的預后價值，研究使用CGGA mRNA芯片數據庫進行生存分析。“Analyze-mRNA data”模塊將PTK7表達分為兩組，高表達組111例，低表達組111例，經生存分析Kaplan-Meier法顯示，PTK7基因表達與腦膠質瘤的總生存率(overall survival, OS)相關(P<0.001)，PTK7基因mRNA低表達組預后優于高表達組。在復發腦膠質瘤病例中，PTK7基因高、低表達組間的OS差異具有統計學意義(P=0.013)，PTK7低表達組預后優于高表達組(圖5)。

圖5 基于CGGA腦膠質瘤病例的生存分析

2.6 驗證PTK7基因mRNA表達水平與腦膠質瘤預后的關系

為了進一步驗證基于CGGA數據庫的分析結果，分析PTK7基因在腦膠質瘤中的預后價值，研究通過GEPIA進行生存分析，結果(Kaplan-Meier法)顯示在676例TCGA腦膠質瘤病例中，PTK7低表達者預后均優于高表達組，二者的OS 差異有統計學意義(P<0.001，圖6)。PTK7低表達者無病生存優于高表達組，二者之間的差異具有統計學意義(P<0.001，圖6)。

圖6 基于TCGA腦膠質瘤病例的生存分析

2.7 PTK7 PPI關系及GO、KEGG分析

為了探討PTK7可能的作用通路，基于STRING 數據庫，研究構建了蛋白質相互作用網絡，并分析與PTK7相互作用的蛋白分子，結果如圖7所示，共有11個蛋白分子構建成為核心相互作用網絡，相關基因為PTK7、CCK、CCKAR、CCKBR、DVL1、DVL2、DVL3、FZD7、VANGL1、VANGL2和WNT5A。對上述基因進行GO功能分析結果提示,其主要參與平面細胞極性通路、耳蝸形態發生、Wnt信號通路等29個功能過程(圖8)。KEGG通路分析結果顯示上述基因參與Wnt通路、基底細胞癌、黑色素生成、調節干細胞多能性、Hippo通路、人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌癥通路和Notch通路等8個通路(圖9)。

圖7 PTK7相關蛋白質相互作用網絡圖

圖8 PTK7相關基因本體(GO)功能分析結果

圖9 PTK7相關基因KEGG信號通路富集分析結果

3 討 論

腦膠質瘤的發生和發展過程極其復雜，是由多種因素共同作用的結果。盡管在過去的幾十年中，神經膠質瘤的治療已有很大進展，但是大多數患者的臨床結局仍然欠佳，尤其是膠質母細胞瘤。近年來，手術聯合放療和替硝唑胺化療已經成為膠質母細胞瘤的標準治療方案，但是即使接受相同的治療，患者的生存期也明顯不同。生存期受很多因素影響，包括治療策略、患者的身體狀態、腫瘤的特征等。與這些因素相關的標志物往往是膠質瘤患者預后評價的關鍵，針對相關標志物的靶向治療將成為未來腦膠質瘤治療方面的突破點。

蛋白激酶是真核細胞中最大的一個基因家族，依據激酶、非激酶區域和跨膜的結構域，將蛋白激酶劃分為受體依賴型受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)和非受體依賴型RTKs[12]。蛋白激酶介導了真核細胞內大多數的信號傳導，調控大部分細胞內蛋白的功能，參與發育過程中的細胞內通訊，參與生理反應和內穩態等[13-15]。因此，蛋白激酶突變和調控異常導致了人類疾病，這也為使用酶類的激動藥和拮抗藥治療疾病提供了可能。越來越多的研究表明酪氨酸激酶在各種類型腫瘤中均起重要作用，而RTKs已成為腫瘤藥物研究中受到重點關注的靶點[15-16]。

本研究發現PTK7mRNA在腦膠質瘤組織中表達升高，表達水平隨著腦膠質瘤分級升高，這與既往腦膠質母細胞瘤研究結果一致[17]。PTK7在腦膠質瘤中存在突變和擴增。臨床參數分析顯示PTK7表達與腦膠質瘤的WHO分級、IDH狀態和病理類型相關(P<0.001)，而與其他臨床因素如年齡、性別等無相關性?；贑GGA數據的生存分析顯示PTK7基因mRNA低表達組預后優于高表達組(P<0.001)，在復發腦膠質瘤中同樣存在上述差異(P=0.013)?；赥CGA數據點生存分析印證了PTK7低表達者預后均優于高表達組，OS和DFS差異均具有統計學意義(P<0.001)。而既往學者研究顯示，與低表達PTK7的腦膠質瘤相比較，高表達PTK7的多形性膠質瘤患者預后更差[17]。該研究與我們的分析結果一致，即在腦膠質瘤病例中，PTK7高表達意味著預后不良。

PTK7是WNT/β-catenin和WNT/PCP信號傳導途徑中的常見成員，可能在這兩個信號傳導途徑中發揮正向或負向作用[18-20]。研究顯示PTK7調控細胞極性[21]，并且與RACK1,Cdx和PlexinA1有相互作用[22-23]，是WNT信號通路的調控因子，作用于Frizzled受體，并作為GSK3β的上游調節信號[20,24]。Wnt信號通路在神經發生和干細胞增殖中發揮功能，被證實在腦膠質瘤的發生和發展中起著關鍵作用[25]。此外，PI3K/Akt/mTOR途徑與腦膠質母細胞瘤的生長、代謝、存活、血管生成、自噬和化療耐藥性密切相關[26]。在本研究中，PTK7在腦膠質瘤中高表達也預示預后不佳。而PTK7在血液腫瘤[27]、肺癌[28]、結腸癌[6]、乳腺癌[29]、食道癌[30]以及肉瘤[10]等出現過表達則同樣提示不良預后。這些數據進一步支持PTK7未來作為腫瘤新藥研究的候選靶標[31-33]。

總之，本研究結果提示PTK7表達水平和腦膠質瘤的臨床病理參數和臨床預后有關，但PTK7的預后價值仍需要在蛋白水平進行驗證。PTK7作為酪氨酸蛋白激酶家族成員，如果未來能夠明確其臨床價值和功能機制，或將有希望成為腦膠質瘤的治療新靶點，在精準治療中發揮作用。

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