苦參堿對免疫低下小鼠的脾/胸腺指數、耳腫脹度、碳廓清能力的影響

曹曉東 ，張 楠 ，張子英 ，劉 穎 ，杜 華 ，韓 帥

（1.內蒙古醫科大學GLP中心，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古醫科大學公共衛生學院，內蒙古 呼和浩特 010018；3.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；4.內蒙古醫科大學實驗動物中心，內蒙古 呼和浩特 010018）

機體的免疫系統是維持機體正常運轉、抵御外界刺激的重要保證，近20年來自身免疫性疾病和過敏性疾病的發病率呈不斷上升趨勢[1]。使用中藥來增強免疫力，具有副作用小、來源廣泛的優勢。以中藥養生和中醫體質辨識為基礎，對中藥中免疫功能活性物質進行研發已經成為中藥研究的熱點問題。Matrine的來源非常廣泛，可從大多數豆科植物中提取，含量最為豐富的是苦參和苦豆子等植物，其藥理作用主要包括抗炎、抗過敏、抗病毒、鎮痛、平喘、抗肝纖維化、抗腫瘤和免疫調節等[2]。Matrine對小鼠的免疫功能具有雙向調節作用，但matrine調節免疫功能的效應復雜，系統地研究matrine對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用不僅有利于將matrine作為免疫調節藥物拓寬研發探索途徑，還可以為全面了解matrine的免疫調節作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物。SPF級昆明小鼠60只，體重為18～22 g，雌雄各半，購買自內蒙古醫科大學實驗動物中心 (生產許可證號：SCXK-2020-0001；批準號：京動字 8910M047)，自由飲食，飼養環境符合GB-14925-2010實驗動物環境及設施要求，適應性飼養3 d后，采用分層分組法進行分組，分為空白對照組（CON）、免疫功能低下組(環磷酰胺)、左旋咪唑(levamisole)陽性對照組，以及matrine高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。

1.1.2 試劑與儀器。matrine（批號：20200912，Solarbio公司），MTT 試劑（Sigma 公司），胎牛血清（Gibco 公司），胰酶-EDTA消化液（Hyclone公司）；96孔細胞培養板（Corning 公司），CO2培養箱（美國 Thermo 公司）；倒置熒光顯微鏡 （Olympus），環磷酰胺（cyclophos phamide，CTX）(Sigma 公司)，刀豆蛋白（concanavalin A，Con A） (Sigma公司)，左旋咪唑(levamisole)，二硝基氯苯丙酮，印度墨汁（phygene biotechnology），2%綿羊紅細胞 （北京博爾西科技有限公司），都氏試劑，10%豚鼠補體，小鼠脾淋巴細胞分離液試劑盒（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）。

1.2 試驗方法

免疫功能低下組(環磷酰胺)、matrine高劑量組、中劑量組和低劑量組，4組用于制備免疫力低下的小鼠模型，于試驗第1天腹腔注射150 mg/kg劑量的環磷酰胺；第2天環磷酰胺劑量為80 mg/kg，第3天與第2天注射劑量相同。空白對照組 （CON）、左旋咪唑(levamisole)陽性對照組腹腔分別注射相同體積的生理鹽水。之后，matrine高、中、低劑量組腹腔注射matrine，高劑量組為160 mg/kg，中劑量組為80 mg/kg，低劑量組為40 mg/kg。連續給藥7 d，對照組和左旋咪唑組腹腔分別注射相同體積的生理鹽水和40 mg/kg體重的左旋咪唑。

給藥第7天進行遲發型變態反應耳郭腫脹度檢測（DTH）和碳廓清試驗，之后對小鼠進行腹腔注射2%致敏紅細胞(SRBC)0.2 mL/只。連續注射3 d，之后再過5 d（即給藥后第15 d）對小鼠進行眼眶后靜脈叢取血和血清溶血素含量的測定。小鼠CO2安樂死，進行腹腔巨噬細胞增殖試驗，脾/胸腺指數測定，并且制備細胞懸液完成脾淋巴/胸腺細胞轉化試驗。

1.3 統計方法

試驗數據由IBM SPSS statistics 21軟件進行分析，分析方法為單因素方差分析法，方差齊性檢驗則用LSD法；方差不齊使用Dunnett T3法檢測，計量資料均以x±s表示。

2 結果

2.1 matrine對免疫低下小鼠脾/胸腺指數的影響

圖1結果顯示，同空白對照組相比，環磷酰胺可以提高脾臟指數、降低胸腺指數，結果無統計學意義（P＞0.05）；而 matrine 高、中、低 3 個劑量組均可增加免疫低下小鼠脾/胸腺指數，但是結果無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 matrine對免疫低下小鼠模型脾/胸腺指數的影響

2.2 matrine對免疫低下小鼠模型細胞免疫的影響

圖2A結果顯示，與空白對照組相比，環磷酰胺對小鼠的耳腫脹度影響差異無統計學意義。左旋咪唑組可以顯著增加免疫低下小鼠的耳腫脹度（P＜0.05）； 高劑量的 matrine 能顯著增加免疫低下小鼠的耳腫脹度（P＜0.05），中低劑量組雖有影響，但無統計學意義。圖2B、2C結果顯示，與空白對照組相比，環磷酰胺能降低小鼠的脾淋巴細胞 （P＜0.05），但matrine高、中、低3個劑量組均對免疫低下模型小鼠的脾轉化率影響不明顯（P＞0.05）；matrine高、中、低 3 個劑量組均能顯著增加免疫低下小鼠的胸腺指數（P＜0.01）。

圖2 matrine對免疫低下小鼠模型T細胞介導的免疫反應的影響

2.3 matrine對免疫低下小鼠抗體形成細胞（B淋巴細胞）的影響

圖3結果顯示，與空白對照組相比，左旋咪唑組能降低HC50，但不顯著；matrine和環磷酰胺組均未對免疫低下小鼠的HC50產生影響，與空白對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。

圖3 matrine對免疫低下小鼠模型體液免疫的影響

2.4 matrine對免疫低下非特異性免疫功能的影響

圖4B結果顯示，與空白對照組相比，左旋咪唑組能極顯著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），同時matrine中劑量組增加效果顯著（P＜0.05），低劑量組增加效果極顯著（P＜0.01）；圖4A結果顯示，左旋咪唑組能極顯著增加免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的增殖能力（P＜0.01），與空白對照組相比，matrine高、中劑量組腹腔巨噬細胞的增殖能力增加效果均顯著（P＜0.05）。

圖4 matrine對免疫低下小鼠模型非特異性免疫功能的影響

3 討論

近年來，中藥對免疫系統調節功能的研究日益重要。合理地開發利用中藥藥材資源，提高動物機體免疫力，具有多重經濟和社會價值[4-5]。Matrine能顯著抑制正常小鼠巨噬細胞的吞噬功能；抑制血清溶菌酶活力、抗體形成細胞的產生和血清溶血素的生成[6]。機體免疫功能表現亢進時，脾臟細胞也相應地增殖[7]。Matrine一方面可以顯著降低免疫功能正常的T淋巴細胞功能，另一方面又可以增加免疫抑制組的T淋巴細胞免疫功能。這體現出matrine對免疫系統調節的雙向性。盡管有關于matrine對于健康小鼠細胞免疫、體液免疫等方面的免疫調節作用研究，但沒有建立免疫低下小鼠模型，并不能反映matrine對免疫功能狀態低下小鼠的免疫調節作用。本試驗主要從免疫器官、細胞免疫和體液免疫幾個方面，探究了matrine對免疫低下小鼠模型的影響，從而明確matrine對免疫功能低下小鼠模型的免疫調節作用。

本研究中環磷酰胺能提高胸腺指數降低脾指數、抑制小鼠脾/胸腺淋巴細胞轉化率，降低耳腫脹度，說明成功地建立了免疫低下小鼠模型。通過本研究發現，與空白對照組相比，免疫增強劑左旋咪唑和matrine組均能增加胸腺淋巴細胞的轉化率，但二者均不能完全逆轉環磷酰胺抑制的胸腺淋巴細胞轉化情況。

T淋巴細胞的功能狀態在很大程度上能反映出機體的細胞免疫水平[8-9]。左旋咪唑和matrine均能顯著增加免疫低下小鼠耳腫脹度，說明matrine能增強細胞免疫功能。鑒于免疫細胞的數量和刺激劑的不同，免疫細胞在調控機體的免疫功能方面具有重要的作用。而matrine作為免疫抑制藥物在臨床中多用于治療病毒性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病[10]，有必要探討不同劑量的matrine對免疫低下小鼠淋巴細胞轉化的試驗和免疫細胞分泌細胞因子的影響，研究matrine的免疫調控作用。

Matrine和左旋咪唑組均未對環磷酰胺抑制的HC50產生影響，說明matrine未對免疫低下小鼠產生體液免疫調節作用。matrine和左旋咪唑均能顯著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力，說明matrine可以促進巨噬細胞的吞噬功能，matrine和左旋咪唑可提高機體的非特異性免疫功能。

有文獻報道，matrine注射液輔助宮頸癌化療的增敏效果顯著，能有效降低患者CA125及IL-6水平，顯著改善機體T細胞免疫功能[11]；協同環孢素顯著延長小鼠異體移植皮膚存活時間[12]；降低骨髓移植（即異基因造血干細胞移植）小鼠的血清干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平，產生免疫抑制作用。Matrine能上調干擾素-γ和下調白介素水平，還可以抑制支氣管哮喘的炎癥反應[13]。上述疾病均為自身免疫疾病模型，由此可見matrine改善了上述疾病的進程，參與機體的免疫調節過程。

總之，matrine能增強免疫低下小鼠的細胞免疫功能和非特異性免疫功能，本試驗系統地研究了matrine對免疫低下小鼠的免疫調節作用，為臨床開發和利用matrine提供免疫藥理學研究基礎。