miRNAs在膿毒癥致MODS模型犬心力衰竭時的研究

張 健 黃 祥 李發鵬 蘆顏美 邢 強 姜 濤 湯寶鵬

膿毒癥(sepsis)是臨床上常見的一種疾病，發病兇險，治療費用高，病死率高達20%[1]。膿毒癥被認為是一種綜合的炎癥反應綜合征而不是特定的疾病[2]。因為機體發生了感染，進而導致機體功能處于失衡狀態，從而發生危及生命的一種器官功能障礙[3]。一旦發生膿毒癥，心臟不良事件的發生率明顯增高[4]。

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)指的是機體遭受嚴重創傷、休克或感染后，同時或序貫出現2個或更多的器官功能障礙或衰竭，不能維持內環境穩定的臨床綜合征[5]。1995年，Marshall等[6]對ICU的MODS流行病學調查研究，研究提出的評分系統包含6個臟器組織系統——心血管、中樞神經系統(CNS)、血液、肝臟、呼吸和腎臟系統。13%的MODS患者(占ICU患者總數的7%)病死率超過70%。周榮斌對急診成人MODS的流行病學研究中得出，在急診成人MODS患者中，心臟功能產生障礙發生心力衰竭(heart failure, HF)的發生率高達61.2%[7]。

既往研究發現，miRNAs可以作為心臟疾病的一種標志物，miRNAs的相關分型如miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499在心肌組織中均有表達[8～18]。對于以上基因是否在MODS犬發生HF的左心室肌中表達，以及如何表達是本文研究的重點。本文通過在膿毒癥致MODS模型犬中選取發生HF的犬，取左心室肌進行實驗研究，通過研究進一步發現miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499與膿毒癥致MODS犬發生HF的關系。

對象與方法

1.研究對象：健康雌雄比格犬11只，雌雄兼有，實驗前給予常規的體檢工作，主要包括12導心電圖、心臟彩超等相關檢查，結合獸醫對犬的一般常規體格檢查。比格犬的體質量為12.0～15.6(15.0±2.5)kg，年齡為1.5～2.5(1.3±0.7)歲。7只為MODS模型組犬(平均年齡為1.47±0.45歲，平均體質量為14.2±2.5kg)，4只為正常組犬(平均年齡為1.45±0.36歲，平均體質量為14.6±2.0kg)。全部實驗犬由新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心提供(新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心已經通過AAALAC認證)。本次的實驗方案經由新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心倫理委員會審核批準，同時也結合美國國立衛生研究所在1996年制定的動物實驗倫理原則實施。本次實驗制作的MODS犬模型采用的是注射內毒素，同時進行器官支持的方法[21]。實驗結束后選取犬心臟的左心室肌進行實驗研究。實驗結束以后迅速開胸，本著人道主義方法獲取犬的心臟標本。迅速剪取心室組織，用生理鹽水去除標本所含的血液和用剪刀去除標本所含的脂肪組織。迅速將組織放入凍存管中，放置入液氮中快速冷凍，待快速冷凍后轉入-80℃超低溫冰箱凍存備用。剪取部分心室肌組織使用甲醛溶液固定，后期行病理檢查。

2.研究方法：(1)實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)：采用real-time PCR檢測心室肌細胞miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499的mRNA表達。具體操作過程：-80℃超低溫冰箱中取去除血液以及脂肪組織的左心室肌標本100mg。由Invitrogen公司提供Trizol用于提取總RNA(上海生物工程服務有限公司，貨號SK1321)。取2μg總RNA反轉錄成cDNA，反轉錄試劑盒購自上海生物工程服務有限公司(貨號SK2445)。引物序列由Primer Premier5.0軟件設計，見表1。進行real-time PCR反應，其中反應體系由上海睿安生物工程有限公司提供。具體過程為：在0.2ml PCR管中加入以下試劑：5μl總RNA、1μl特異性引物、5μl無核糖核酸酶雙蒸餾水；70℃溫浴5min；冰浴10s；離心加入下列試劑：4μl 5×反應緩沖液、2μl dNTP混合物(10mmol/L)、1μl核糖核酸酶抑制物(20U/L)、2μl反轉錄酶(10U/L)、20μl總容量；37℃溫浴5min；42℃溫浴60min；70℃溫浴10min；將上述溶液于-20℃保存。反應完成后根據2-△△Ct計算得出目的基因mRNA相對表達量。(2)病理檢查:通過使用光鏡以及電鏡(圖1)觀察MODS犬左心室肌結構(光鏡采用HE、PAS、銀染3種染色法，電鏡在2500倍下隨機觀察8～10個視野，在5000～30000倍下觀察左心室細胞的細胞器變化)。

結 果

1.不同類型基因miRNAs引物序列：miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499與內參U6的引物序列表(表1)。

表1 目的基因引物序列

2.不同類型基因表達水平的比較: miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499的mRNA表達詳見表2。對照組與實驗組6種基因的表達水平比較結果顯示，miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499在MODS模型犬發生HF的左心室肌中均有表達。實驗組的miRNA-21的mRNA表達水平(2.21±0.49)顯著高于對照組的mRNA表達水平(0.83±0.14)，差異有統計學意義(t=-5.414，P<0.001)。實驗組與對照組比較，其余5種基因的mRNA的表達水平差異無統計學意義。

表2 對照組與實驗組不同類型基因表達水平的比較

3.病理的光鏡以及電鏡結果：對照組與實驗組比較，實驗組的左心室肌的肌細胞排列順序明顯不整齊、雜亂，部分心肌細胞肌束斷裂，ZM帶線模糊，線粒體其質密度降低，輕微變形，部分線粒體嵴不完整，線粒體水腫，線粒體膜損傷，有自噬溶酶體，部分線粒體形成少量空泡，空泡線粒體散在分布(圖1)。

圖1 左心室肌組織的光鏡及電鏡圖A、B.實驗組左心室肌的光鏡圖(A為銀染法，B為HE染色法)；C、D.對照組左心室肌的光鏡圖(C為銀染法，D為PAS染色法)；E.實驗組左心室肌的電鏡圖；F.對照組左心室肌的電鏡圖。A、C、E放大倍數為5540倍；B、D、F放大倍數為22100倍

討 論

microRNAs (miRNAs) 是一類小分子調控核糖核酸，它們在很多疾病中具有預測作用[19]。miRNAs有著數以千計的高度保守的分型， miRNAs的很多分型在大多數物種中漸漸地被人類熟知和掌握[20]。miRNA-21與膿毒癥炎性細胞因子有相關性。McClure等[21]研究發現，miRNA-21 在膿毒癥的早期及晚期階段都存在高表達，而且進一步研究發現，通過外源的miRNA抑制物阻斷miRNA-21可以降低晚期膿毒癥的病死率。Sheng等[22]研究發現，膿毒癥患者血液中miRNA-21同樣存在著高表達，而且發現間接下調miRNA-21的表達水平可以降低膿毒癥炎性反應。也有研究發現，miR-21的過表達導致促炎性細胞因子的顯著上調，導致它們表現出促炎活性，可以作為炎癥條件下的生物學標志物[23]。上述的研究提示,高表達的miRNA-21可能在膿毒癥的病理生理過程中扮演著不好的角色。

但是另外一些研究結果卻截然相反。我國研究者Yang發現，在敲除miRNA-21基因的小鼠心肌組織中，炎性細胞因子表達水平增高，心功能障礙加重，提示miRNA-21高表達可以抑制炎性細胞因子的產生，導致心功能下降[24]。Bejerano等[25]研究發現，miRNA-21的高表達可以使心臟巨噬細胞表型從促炎型轉變為修復型，進而促進血管生成，減少心肌纖維化，降低了凋亡細胞數量，減弱了左心室的重構。上述的研究提示,高表達的miRNA-21可能在膿毒癥的病理生理過程中扮演著好的角色。

膿毒癥會通過感染或非感染等因素導致機體發生過度炎性反應，進而導致機體發生MODS，這種發生機制其本質是全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SISR)[26]。MODS極易引發心臟病變，如HF。HF是由于心排出量不足而不能滿足體內器官和組織的代謝需要而引起的一種復雜的臨床綜合征。HF由心臟進行性結構和功能改變引起的收縮和(或)舒張收縮功能障礙演變而來[27]。

miRNA-21基本上在所有細胞中表達，是公認的最豐富和高度保守的miRNAs之一[20]。miRNA-21可作為HF診斷和治療的生物學標志物[28，29]。miRNA-21在不同心血管疾病中均表現為失調狀態，其中包括心力衰竭[20]。Galluzzo等[30]研究發現，miRNA-21可能參與了HF進展的惡化，并且可以預測HF的預后。本研究發現，實驗組的miRNA-21的mRNA表達水平顯著高于對照組的mRNA表達水平，說明在膿毒癥致MODS模型犬發生HF時左心室肌中miRNA-21的高表達與膿毒癥致MODS模型犬的HF有關，也就是說，miRNA-21的高表達會導致炎性細胞因子增加，心功能下降。通過MODS模型犬左心室肌組織的病理改變發現，心室肌的肌細胞的確發生了明顯改變，結構發生了異常，說明miRNA-21在膿毒癥致MODS模型犬發生HF時左心室肌中的高表達會導致左心室肌結構發生改變，導致機體損傷。由此筆者大膽預測，miRNA-21的高表達與膿毒癥致MODS發生HF有關。或許miRNA-21高表達可作為膿毒癥致MODS發生HF時的早期預警信號之一。