肥胖相關基因多態(tài)性與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征遺傳易感性的關系

穆婭沙·塔衣爾 曹媛媛 朱 晴 木葉斯爾·木合塔爾 蔡昕添 古再麗努爾·吐爾遜 張德蓮 胡君麗 李南方

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是一種睡眠障礙性疾病，作為多種心血管疾病的危險因素，以夜間反復低氧、睡眠結構紊亂為特征[1]。估計全球有近10億年齡在30～69歲的成年人可能患有OSAHS，而且有增高趨勢[2]。這暗示此疾病常常被低估，給患者身心健康和社會經濟帶來沉重的負擔[3]。與阻塞性睡眠呼吸暫停相關的主要臨床風險是多器官系統(tǒng)損害，如心腦血管疾病、神經認知功能障礙和代謝綜合征[4,5]。OSAHS有明顯家族聚集性和遺傳性，有證據(jù)表明，遺傳因素對OSAHS易感性既有直接影響，也可通過肥胖、顱面結構等“中間表型”間接影響，鑒定決定中間表型的基因可能有助于確定OSAHS易感基因[6，7]。肥胖是OSAHS最重要的危險因素之一，大約2/3的患者伴隨著肥胖[8]。體重指數(shù)(BMI)>29kg/m2會使OSAHS患病風險增加10倍[9]。肥胖基因多態(tài)性與OSAHS易感性之間的關聯(lián)仍然知之甚少，且既往研究往往存在爭議[10,11]。本研究從現(xiàn)有文獻和PHGKB數(shù)據(jù)庫中選取肥胖相關基因，用二代目標靶序列測序技術篩查可能與OSAHS相關的易感基因，探討基因位點與OSAHS易感性之間的關系，為后續(xù)的機制研究打下基礎。

對象與方法

1.研究對象: 納入標準：連續(xù)納入2016年4～12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科住院并疑診OSAHS(有夜間打鼾、無誘因白天嗜睡者、不能解釋的口唇紫紺)的患者。排除標準：①年齡在18周歲以下；②有其他呼吸系統(tǒng)疾病；③惡性腫瘤、急性感染及其他臨床診斷的全身性炎癥性疾病(結締組織性疾病、自身免疫性疾病)；④嚴重的心臟、腦、肝臟、腎臟疾病；⑤嚴重的睡眠障礙與精神障礙；⑥未能完成整夜多導睡眠監(jiān)測(polysomnography，PSG)等。納入根據(jù) AHI值選擇表型極嚴重者(AHI≥50次/時)為重度 OSAHS組與表型正常者(AHI<5次/時)為非 OSAHS 組，研究對象簽署書面知情同意書[12]。本研究經新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批。

2.基線資料收集與檢測：所有受試者的過夜PSG監(jiān)測、臨床數(shù)據(jù)采集、血樣采集和基因組DNA提取均按照前面描述的標準程序進行[12，13]。基線資料包括年齡、性別、頸圍、腹圍、收縮壓、舒張壓，并計算體重指數(shù)(BMI)=體重/身高2(kg/m2)。利用采用BECKMAN全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)。

3.DNA提取和鑒定：將血樣從-80℃冰箱中拿出，室溫放置30～60min解凍。取EP管加入20μl蛋白酶K，加入200μl EDTA抗凝全血和等體積緩沖液BL，劇烈振蕩混勻；放入預熱至56℃金屬浴或水浴中反應10min裂解細胞，待裂解物冷卻后加入200μl無水乙醇，振蕩混勻；將裂解物全部轉移至已活化的吸附柱中，12000r/min離心1min，更換新的收集管，加入500μl BW1，12000r/min離心1min，棄廢液，再加入500μl BW2，12000r/min離心1min，棄廢液；12000r/min離心1min，將吸附柱插在潔凈的EP管中，并加入60μl洗脫緩沖液BE，12000r/min離心1min，收集DNA；測定DNA濃度，范圍在20～50ng/μl，A280/A230>2.0，A260/A280為1.75～1.95。

4.候選基因選擇及二代靶向捕獲測序：聯(lián)合基因-表型數(shù)據(jù)庫(Public Health Gengmics Knowledge Base)，在大量文獻復習及以往研究基礎上，篩選了與肥胖相關基因17個候選基因，對通過目標區(qū)域測序篩選出的高頻 SNPs 位點(MAF>1%)進行進一步關聯(lián)分析。實驗均由上海天昊生物技術有限公司實施。該測序采用多重PCR的方法及Lumina測序技術平臺，對100個樣本的目標序列即所選研究基因的全部外顯子以及側翼序列(質檢合格)進行測序，要求測序深度達到100×通過與大型的人類學數(shù)據(jù)庫及千人組基因庫的數(shù)據(jù)比對分析篩選新的、特異性的突變體。對于發(fā)現(xiàn)的SNP位點應在dbSNP數(shù)據(jù)庫中找到相應的rs號，對于發(fā)現(xiàn)的突變要確定其在cDNA中的位置。

5.基因相互作用網絡分析：用GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出跟OSAHS相關的基因，按相關分數(shù)高低，選出的前50個基因，導入利用互作基因的檢索工具(STRING，11．0 版)，種屬限定為“Homo sapiens”，最小連接評分(combined score)值為0.4，再導出相應結果文件，使用 Cytoscape 軟件(版本3.7.2)可視化 PPI 網絡。

結 果

1.兩組臨床資料比較：根據(jù)納入和排除標準，納入100例受試者，包括非OSAHS組50例，重度OSAHS組50例。發(fā)現(xiàn)重度OSAHS組男性患者明顯高于女性患者(80% vs 20%，P<0.05)。重度OSAHS組患者的體重指數(shù)(BMI)、頸圍、腰圍、甘油三酯水平均明顯高于非OSAHS組，而高密度脂蛋白膽固醇含量明顯低于非OSAHS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而兩組在飲酒史、收縮壓、舒張壓、睡眠效率、總睡眠時間、膽固醇方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組臨床資料比較

2.基因及位點并與OSAHS人群的Logistic回歸分析：從現(xiàn)有文獻和PHGKB數(shù)據(jù)庫中選取肥胖相關基因(CCKAR、CRP、HCRTR2、HCRTR1、INSIG2、LEP、LEPR、LPL、PPARG、UCP1、FABP2、MC3R、MC4R、SERPINE1、TNF、UCP2、UCP3)，進行二代高通量二代測序目標靶序列測序，最終篩查遵循Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)并4種基因模型中至少有1種模型符合(P<0.1)的6個基因，11個位點，分別是：過氧化物酶體受體γ(PPARG)基因的rs12486170、rs17036160位點，解偶聯(lián)蛋白1 (UCP1)基因的rs3811790位點，解偶聯(lián)蛋白2 (UCP2)基因的rs660339位點，脂肪酸結合蛋白2 (FABP2)基因的rs2964、rs1511025位點，HCRTR2基因的rs12486170、rs6937662、rs9370399、rs77680302位點，腫瘤壞死因子(TNF)基因的rs1800630位點。對11個位點進行簡單及多因素Logistic回歸分析，對性別、年齡、BMI校正以后，結果表明，PPARG基因rs12486170位點(OR=0.260，95% CI：0.079～0.852，P=0.026)和TNF基因rs1800630位點(OR=4.907，95% CI：1.112～21.666，P=0.036)分別是患OSAHS的保護因素和危險因素。與其余位點無相關性(P>0.05，表2)。

表2 基因位點與OSAHS人群的Logistic回歸分析

3.基因位點基因型及等位基因頻率分布特征：篩選的OSAHS易感基因位點基因型及等基因位分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律 (P>0.05)，基因頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。由于篩選出的SNP位點數(shù)目較多，結果部分僅列出在后多因素Logistic回歸分析中兩組間有差異的變異位點。非OSAHS組與重度OSAHS組比較，兩組TNF基因rs1800630位點(χ2=6.282，P=0.043)位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，PPARG基因rs12486170位點基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

表3 基因多態(tài)性與非OSAHS組與重度OSAHS組分布頻率的比較[n(%)]

4.基因位點的各基因型與OSAHS易感性的關系：以研究對象是否患OSAHS為因變量，選取多因素有差異的PPARG基因rs12486170位點和TNF基因rs1800630的各基因型與等位基因為協(xié)變量，經調整年齡、性別和BMI后進行Logistic回歸分析，評估了在加性、顯性、隱性模型與OSAHS風險。結果顯示，PPARG基因rs12486170位點在顯性模型當AG和GG基因型聯(lián)合使用時，聯(lián)合組的OSAHS風險降低(OR=0.260,95% CI：0.079～0.852，P=0.026)。其余加型、隱形模型差異均無統(tǒng)計學意義。TNF基因rs1800630，在加性模型中，A等位基因攜帶者患OSAHS風險明顯高于C等位基因攜帶者(OR=3.342,95% CI:1.013～11.029,P=0.048)。在顯性模型中，具有CA/AA基因型患OSAHS風險相對于CC基因型顯著增加(OR=4.907，95%CI：1.112～21.666，P=0.036)。隱形模型基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

表4 基因位點各基因型與OSAHS易感性的關系

5.基因位點與OSAHS患者臨床指標關系：基因型-表型關聯(lián)分析結果顯示，PPARG基因rs12486170位點AA基因型與AG/GG基因型及rs1800630位點CC基因型與CA/CC基因型分別與OSAHS患者的BMI、頸圍、腰圍、AHI、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而攜帶rs12486170 AG/GG基因型的受試者AHI明顯低于AA型(P=0.019)。TNF基因rs1800630有CA/AA基因型的個體OSAHS相對于CC基因型且AHI明顯低于CC型(P=0.013，表5)。

表5 基因型與各臨床指標的關系

6.基因與OSAHS相關基因相互作用網絡分析：用GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出OSAHS相關的基因關聯(lián)強度最高的前50個基因，導入利用互作基因的檢索工具(STRING，11.0版)，種屬限定為“Homo sapiens”，最小連接評分(combined score)值為0.4，再導出相應結果文件，使用 Cytoscape 軟件(版本3.7.2) 可視化 PPI 網絡，最終50個基因產物在字符串數(shù)據(jù)庫中顯示出潛在的物理相互作用，從而形成一個復雜的多中心互動網絡。將互作顯著的基因導入Cytoscape計算拓撲特征。OSAHS結47個結節(jié)和484個邊緣，最大連接值為43，越大的連接性值表明蛋白質之間有很強的相互作用，因此有助于穩(wěn)定網絡模型的關鍵性質，PPARG與TNF連接值分別為38與31，進一步證實兩個基因與OSAHS的相關性(圖1)。

圖1 互動網絡的拓撲特征

討 論

OSAHS是一種以夜間睡眠打鼾、呼吸暫停和日間嗜睡為特征的睡眠呼吸紊亂疾病，可導致間歇性低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結構紊亂,是一種發(fā)生率較高且具有潛在危險的疾患，它能引起一系列并發(fā)癥，嚴重時可導致睡眠時猝死[14]。OSAHS多發(fā)于肥胖患者大約2/3的患者伴隨著肥胖，已知 OSAHS是可遺傳的，大約 40% 的 AHI 變異可歸因于遺傳因素，可以通過肥胖等“中間表型”找到OSAHS的易感基因，可進一步應用到臨床實踐中[6]。本研究對選取的肥胖相關基因中進行全部外顯子以及側翼序列進行高通量二代測序，最后從選出的6個基因，11個位點中，發(fā)現(xiàn)PPARG基因rs12486170位點和TNF基因rs1800630位點分別是患OSAHS的保護因素和危險因素，且基因多態(tài)性增加了人群對OSAHS的易感性。可通過檢測位點基因型來評估OSAHS的風險程度。

腫瘤壞死因子(TNF),又稱惡液質素。TNF主要由活化的巨噬細胞，NK細胞及T淋巴細胞產生。既往研究主要聚集在TNF與冠心病、自身免疫性疾病、乙型病毒感染等疾病的關系[15，16]。人類肥胖與循環(huán)TNF增加有關，這是一種導致肝細胞死亡的促炎性細胞因子。研究表明，肥胖人群和動物的血清TNF水平較高，是由脂肪組織來源的巨噬細胞產生的。TNF細胞因子通過自分泌和旁分泌機制調節(jié)脂肪細胞的增殖和凋亡，促進脂肪分解，抑制脂質合成，降低血脂[17]。最近TNF與OSAHS風險的關聯(lián)已被廣泛評估，TNF抑制已被證明改善OSAHS的進展[18]。TNF基因多態(tài)性與OSAHS的關系也有研究[19，20]。過氧化物酶體受體γ(PPARG)是核受體家族的成員，PPARG與肥胖的發(fā)展有關，PPARG激活脂肪細胞分化，并介導脂肪細胞特異性基因的表達，PPARG基因多態(tài)性與肥胖的關系也有研究[21]。研究顯示，PPARG在OSAHS底層病理生理機制中發(fā)揮重要作用[22]。本研究中更加證實了OSAHS與這兩種基因的關系，并找到OSAHS易感基因位點。

本研究觀察到PPARG基因rs12486170位點中，具有AG/GG基因型比較，AA基因型的OSAHS的風險降低，TNF基因rs1800630位點，具有CA/AA基因型中，OSAHS風險相對于CC基因型顯著增加，在臨床上可作為遺傳性標記進行檢測，在一定程度上發(fā)現(xiàn)預防高危人群。基因表型與臨床資料的關系中，得出兩個位點與AHI有相關性，進一步證實rs12486170與rs1800630是的OSAHS易感基因。最后的基因互做網絡圖中更容易看出，TNF與PPARG與OSAHAS的相關性強度，這個在人群中也被證實。

本研究雖然嚴格挑選了進入對照組的非 OSAHS患者，使其能在性別、年齡、體重指數(shù)上與病例組患者相匹配，但由于這些混雜因素是該病的強危險因素，本研究未能找到足夠質量的肥胖、男性而無OSAHS的對照樣本。因此在分析基因遺傳變異不同遺傳模型下對OSAHS的影響時，筆者利用多因素Logistic回歸校正了性別、年齡、BMI的影響。本研究存在一定局限性：(1)根據(jù)復雜疾病外顯子測序研究策略，考慮到實驗速度和成本，選擇了每組50 例作為樣本。小樣本篩選出的易感基因在驗證隊列中不能得到很好的復制，后續(xù)的研究需擴大樣本量重復驗證本研究結果，以提高結論的外推性。(2)不同人群的遺傳背景不同，基因型分布頻率在不同人群中可能存在差異，為提高研究對象的群體代表性，今后可在不同民族人群中重復驗證。(3)篩選出的易感基因還需要通過細胞或動物實驗進一步進行功能研究，為最終揭示OSAHS發(fā)生、發(fā)展的分子機制，控制OSAHS的發(fā)生提供更多的科學依據(jù)。