外源性補充酮體對肥胖小鼠心肌線粒體功能及氧化應激的影響

齊寶文 呂 娟 王鳳霞 余小林

近年來肥胖的患病率在全球范圍內顯著增加，肥胖患者常常伴隨糖/脂代謝異常、內皮功能障礙、缺氧和線粒體功能受損等一系列病理生理改變，上述病理生理改變均會加重心功能障礙[1]。心臟能量多來自線粒體氧化磷酸化，而損傷的線粒體卻是活性氧產生最主要的場所，活性氧的爆發會極大破壞細胞組分如蛋白質、脂質和DNA[2, 3]。因此，針對肥胖患者的心肌線粒體保護受到了廣泛的重視。

心臟線粒體主要的能量底物包括脂肪酸、葡萄糖、酮體和氨基酸等[4]。目前對肥胖狀態下心肌葡萄糖和脂肪酸的代謝紊亂已解析的較為清楚，但包括酮體在內的小眾代謝底物的作用卻知之甚少[5, 6]。研究發現某些病理狀態下心臟對酮體的依賴增加[7]。酮脂灌胃可以外源性的補充酮體，一定范圍內的高濃度酮體水平在細胞層面被證實可以抑制炎性小體的形成，減少炎性細胞因子的釋放，也可以抑制心力衰竭患者的氧化應激，減輕心臟重構[7～9]。但其對肥胖人群心肌線粒體功能及氧化應激的作用尚不清楚。本研究通過構建肥胖小鼠模型，進而論證外源性補充酮體對心肌線粒體呼吸能力和心肌氧化應激的影響。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：普通飼料：總能量352kcal/100g，其中蛋白質25.7%，脂肪13.8%，碳水化合物5%，購自斯萊克實驗動物有限公司。高脂飼料：總能量473kcal/100g，其中蛋白質20.0%，脂肪45%，碳水化合物35%，購自江蘇美迪森生物醫藥有限公司。酮脂購自美國MCE公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。線粒體呼吸測定相關試劑：寡霉素A(oligomycinA)、抗霉素A(antimycinA)、腺苷-5′-二磷酸(ADP)購自美國Sigma-Aldrich公司。OxyblotTMprotein oxidation試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。PVDF轉印膜、ECL發光液購自美國 Millipore公司。Seahorse XFe24能量代謝儀購自美國Agilent公司。

2.動物分組和模型建立：本研究符合《美國NIH實驗室動物使用指南》的規定，選用30只4周大雄性C57BL/6J小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)飼養于標準清潔級環境。對照組(n=10)小鼠給予普通飼料；其他小鼠給予高脂飼料喂養12周，每周監測小鼠體質量及進食量。之后將高脂飼料喂養的小鼠隨機分為模型組(n=10)及酮脂灌胃組(n=10)。酮脂灌胃組使用酮脂(1mg/g)灌胃4周，對照組和模型組灌胃等體積0.9%NaCl溶液4周。

3.葡萄糖耐量測試：對照組和模型組小鼠禁食6h，通過尾靜脈測量空腹血糖之后，腹腔注射2g/kg D-葡萄糖，分別在注射后15、30、60和90min，用血糖儀測量尾靜脈血糖變化，并計算葡萄糖耐量曲線下面積。

4.經皮超聲檢測：彩色多普勒超聲觀察對照組和模型組小鼠心臟運動。小鼠麻醉誘導后，仰臥位固定于恒溫板上，胸前區備皮。設置超聲探頭的探測深度為15mm，取胸骨旁左心室短軸切面，穩定小鼠心率在500次/分左右，記錄并分析M模式下小鼠左心室射血分數、左心室短軸縮短率。

5.心肌線粒體功能檢測：使用組織線粒體分離試劑盒分別提取3組小鼠心肌組織線粒體，通過BCA蛋白檢測試劑盒進行線粒體蛋白濃度測定。參照文獻[10]，使用Seahorse XFe24能量代謝儀對心肌線粒體功能進行檢測。實驗前1天水化激活探針板，實驗當天配置線粒體測試溶液(mitochondrial assay solution，MAS)溶液，MAS液內加入底物丙酮酸(10mmol/L)/蘋果酸(5mmol/L)，細胞板每孔添加5μg線粒體及 50μl MAS混合液，離心使線粒體貼壁，之后每孔添加450μl MAS混合液，于無CO237℃恒溫箱孵育10min。探針板內依次加入56μl (4mmol/L)ADP，62μl(2.5μg/ml)oligomycinA，69μl(4μmol/L)FCCP、76μl(4μmol/L)antimycinA，放入Seahorse XFe24分析儀，探針校準后將載有線粒體的細胞板置入進行檢測。對得到的線粒體耗氧率(pmol/min)進行統計，添加oligomycinA之前測得的數值減去添加antimycinA之后測得的非線粒體呼吸即線粒體基礎呼吸，添加FCCP之后測得的數值減去非線粒體呼吸即線粒體最大呼吸。

6.蛋白質免疫印跡法檢測：分別提取3組小鼠的心肌總蛋白，BCA法定量后取50μg 樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳蛋白分離，將PVDF膜用5%白蛋白在室溫下封閉1h。隨后加入一抗溶液，在4℃下搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，加入二抗溶液室溫搖床孵育1h，TBST洗膜3次后ECL法顯影。另取20μg蛋白按照OxyblotTMProtein Oxidation試劑盒說明制備樣品，電泳后對DNP殘基顯影反映蛋白羰基化程度。用Image J測得總蛋白羰基化灰度值和內參蛋白GAPDH灰度值之比作為總蛋白過氧化的相對表達值。

7.MDA與SOD檢測：3組小鼠分別取20mg心肌組織，加入裂解液勻漿后，10000×g離心10min取上清后按照MDA含量檢測試劑盒和SOD活性檢測試劑盒說明進行操作。上清液蛋白濃度使用BCA法定量校正后得到MDA含量(μmol/g)及SOD活性(U/g)。

結 果

1.高脂飲食誘導與葡萄糖耐量檢測：給予4周大小鼠高脂飲食喂養12周，構建肥胖小鼠模型(圖1A)。在每日食物攝入量相似的情況下，高脂飲食喂養的小鼠體質量增幅比對照組小鼠體質量增幅更大(P<0.01，圖1B)；葡萄糖耐量檢測結果顯示，與對照組小鼠比較，模型組小鼠葡萄糖耐受能力明顯下降(P<0.001，圖1中C、D)。

圖1 高脂飲食喂養小鼠12周構建肥胖模型

2.肥胖小鼠心功能評估：于16周行經胸部超聲檢測小鼠心臟收縮功能(圖2A)，與對照組比較，模型組心臟左心室射血分數有所下降(P<0.05，圖2B)，左心室短軸縮短率明顯下降(P<0.01，圖2C)。

圖2 高脂飲食喂養小鼠心功能變化

3.酮脂灌胃對肥胖小鼠線粒體呼吸功能與氧化應激的作用：Seahorse能量代謝儀檢測結果顯示(圖3中A～C)，與對照組比較，模型組小鼠心臟線粒體有氧呼吸顯著降低，包括ADP激發的基礎呼吸和FCCP激發的最大呼吸(P均<0.01)；與模型組比較，酮脂灌胃的小鼠線粒體呼吸得到改善，ADP激發的基礎呼吸和FCCP激發的最大呼吸均明顯提高(P值分別為<0.05、<0.01)。氧化應激相關指標檢測包括(圖3中D～G)心肌組織脂質過氧化終產物MDA含量、SOD活性及蛋白羰基化水平，結果提示，與對照組比較，模型組MDA含量大幅上升(P<0.001)，SOD活性明顯下降(P<0.001)，蛋白羰基化更顯著(P<0.01)；與模型組比較，酮脂灌胃組心臟MDA含量減少(P<0.01)，SOD活性有一定提高(P<0.01)，蛋白羰基化水平降低(P<0.05)。

圖3 第16周各組小鼠心肌線粒體功能及氧化應激相關指標的比較

討 論

在本研究中，通過12周高脂飲食喂養，觀察到小鼠體質量明顯上升，伴隨葡萄糖耐量能力下降，認為小鼠肥胖模型誘導成功[11]。通過心臟超聲檢測發現，與正常小鼠比較，肥胖小鼠左心室射血分數及左心室短軸縮短率下降，提示心功能受損。心臟功能異常與心肌線粒體功能損傷關系密切，正常線粒體發揮主要功能的是復合體Ⅰ，利用Seahorse能量代謝儀檢測到肥胖小鼠由復合體Ⅰ的底物丙酮酸和蘋果酸驅動的線粒體呼吸受損[12]。

細胞內線粒體氧化底物供能的同時也不可避免產生副產物活性氧簇，過量活性氧的產生超過細胞抗氧化系統的代償能力時會引起心肌結構和功能的改變[13, 14]。肥胖作為一種代謝性的疾病，病理機制非常復雜，其中由于局部的氧化應激增強引起的線粒體功能障礙對于細胞和組織是非常不利的[6, 15]。因此本研究試圖將肥胖這一以代謝改變為主的綜合征，與心肌氧化應激及線粒體功能損傷聯系起來，找到有效干預措施來減輕肥胖小鼠的心肌氧化應激，改善線粒體功能。

健康心臟首選的能量底物是乙酰輔酶A(脂肪酸的主要代謝物)，某些病理情況下，心臟對脂肪酸的利用減少，能量供應不足導致心臟代謝重編程，對酮體利用增加[16]。研究證實，酮體除了可以在營養缺乏和低碳水化合物飲食的過程中作為大腦、心臟、骨骼肌等肝外組織的替代能源，還可以作為信號轉導介質、蛋白質翻譯后修飾的驅動因子[16,17]。

外源性補充酮脂能有效提高循環酮體水平，包括β-羥基丁酸、乙酰乙酸酯和丙酮[17]。有研究發現，在人胚胎腎細胞，β-羥基丁酸可以通過促進組蛋白乙酰化來增加抗氧化基因的表達，從而減輕細胞氧化應激，也有研究發現運動員在服用含酮脂的飲料后身體耐力和運動表現都得到了提高。總之，酮體的作用已經在細胞、動物及在體層面都得到了解釋。但尚未有研究針對肥胖人群探討外源性補充酮體對心臟的影響[18]。因此本研究通過構建肥胖小鼠模型，發現灌胃酮脂使得肥胖小鼠心肌組織線粒體呼吸功能得到改善，蛋白過氧化即蛋白羰基化水平顯著降低，脂質過氧化終產物丙二醛含量也明顯降低，伴隨超氧化物歧化酶活性的提高，從多角度證明了外源性補充酮體對肥胖小鼠心臟氧化應激及線粒體有氧呼吸的改善作用。

本研究也存在一定的不足，酮體對肥胖小鼠心臟氧化應激的保護作用，可以擴展到其他組織進行全身性的探索。此外酮體減輕心臟氧化應激的具體機制，還需要對照相關通路進行深入研究予以證實。