蒼附導痰湯對PCOS大鼠卵巢細胞線粒體調節機制研究

李 威 陳 靜 樊銳鋒 匡洪影 徐邱鴻 潘紫萌

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)屬中醫 “閉經”、“不孕”范疇，對中醫證候成因的研究表明，線粒體功能異常可能是“脾失運化，聚濕成痰”的生物學基礎[1，2]。PCOS患者的卵巢中ROS水平異常升高、線粒體DNA拷貝數降低，提示PCOS患者卵巢細胞功能變化可能與線粒體活性的改變相關[3]。PCOS患者卵巢組織存在磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路異常，而PI3K通路及其下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細胞調節線粒體活性關鍵機制之一[4]。這預示著胰島素信號通路的異常也可能影響細胞的線粒體功能。

中藥“蒼附導痰湯”能治療PCOS患者生殖及代謝異常表現，而且能通過調節PI3K/mTOR信號通路降低PCOS大鼠的胰島素抵抗指數及血清睪酮水平[5，6]。筆者推測該方劑的療效機制很可能與其對細胞線粒體活性的調節有關。本研究應用蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠進行干預治療，并應用慢病毒包被的mTOR基因的shRNA表達載體進行卵巢原位注射，觀察關鍵因子表達水平的改變對中藥療效的影響，為闡明PCOS的可能病因及中藥復方療效機制提供證據支持。

材料與方法

1.實驗材料：(1)實驗動物：體質量為50±5g的清潔級雌性23 日齡SD 大鼠購自黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物許可證號[SCXK(黑)2013-001]。飼養于12h 晝夜交替環境下,自由攝取食水。實驗過程中對大鼠的操作均按照黑龍江中醫藥大學實驗動物使用與醫學倫理學委員會標準執行,符合動物福利的基本原則。(2)主要試劑：實驗用“蒼附導痰湯”由蒼術、香附、半夏、陳皮、茯苓、膽南星、枳殼、生姜、炙甘草組成，組方中藥購自廣州康美藥業股份公司，煎煮濃縮至1.81g/ml生藥；抗體P110、AKT、mTOR、Drp-1、Fis-1、Mfn-1購自英國Abcam公司，抗體β-actin購自美國Santa Cruz公司；慢病毒包被的mTOR shRNA序列及scramble序列表達載體的慢病毒購自上海基凱生物公司，效價均為1×109TU/ml，其中載體自身攜帶的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)序列與所表達的mTOR siRNA序列或scramble序列為非融合表達。大鼠mTOR shRNA序列及相對應的scramble序列參考已發表的文獻[7]。TUNEL染色試劑盒及Mito-Tracker Red CMXRos購自上海碧云天公司。

2.實驗方法：(1)實驗動物分組及模型構建：共25只實驗大鼠除對隨機選出的對照組大鼠(5只)每日給予0.2ml大豆油頸背部皮下注射外，其余實驗動物均給予使用大豆油配制的6.0mg/100g DHEA，0.2ml頸背部皮下連續注射21天。按照本課題組已發表的PCOS大鼠模型評估方法隨機選取3只大鼠進行模型評估后，構建模型成功的大鼠隨機分為模型組(n=5)、中藥治療組(n=6)及ShRNA注射組(n=6)[8]。(2)表達載體卵巢局部注射：實驗大鼠經1%戊巴比妥麻醉，于背部開口暴露卵巢。使用微量進樣器抽取10μl病毒原液注射入卵巢包膜中：對照組、模型組及中藥治療組注射Lenti-GFP-mTOR shRNA scramble序列表達載體，shRNA干涉組注射Lenti-GFP-mTOR shRNA表達載體。(3)中藥治療：根據實驗動物藥物用量的換算公式，在卵巢局部注射慢病毒包被載體后，中藥治療組及shRNA干涉組給予每次1.5ml蒼附導痰湯濃縮藥物、對照組及模型組大鼠使用1.5ml 0.9%NaCl注射液每天灌胃2次，連續灌胃治療15天。(4)卵巢組織切片：實驗大鼠眶靜脈叢采血后斷頸處死，部分卵巢進行石蠟包埋并切片， HE染色觀察卵巢形態；其余卵巢組織冷凍切片后使用熒光顯微鏡觀察GFP表達情況。(5)排卵數統計：各組雌性大鼠，進行超數排卵后獲取的卵丘-卵母細胞復合體經透明質酸酶消化，統計卵細胞數量。(6)凋亡檢測：按照TUNEL染色試劑盒推薦步驟對卵巢組織切片進行染色后，觀察綠色熒光信號分布情況。(7)免疫熒光染色：分別使用兔抗大鼠mTOR一抗及羅丹明標記二抗對卵巢組織切片中的mTOR蛋白進行熒光標記，熒光顯微鏡下觀察卵巢組織mTOR因子的表達情況。(8)血清激素水平檢測：實驗大鼠眶靜脈叢取血后，靜置30min后2000r/min離心10min獲取血清。采用ELISA試劑盒按照推薦步驟對血清中睪酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、雌二醇(estradiol，E2)進行檢測。(9)顆粒細胞線粒體活性及線粒體融合狀態檢測：獲取各組大鼠卵巢顆粒細胞進行體外培養。細胞貼壁后，部分細胞更換含終濃度為50nmol/L的Mito-Tracker Red CMXRos培養基，37℃孵育30min后，觀察細胞內590nm紅色熒光強度。其余顆粒細胞，固定后分別與兔抗大鼠TOM20一抗及FITC標記山羊抗兔二抗雜交，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內線粒體聚集狀態。(10)實時定量熒光PCR：使用Trizol法抽提卵巢組織中的總RNA，經反轉錄酶對mRNA進行反轉錄后，使用實時定量熒光PCR儀對目標基因進行擴增。采用SYBR Green熒光染料定量試劑及2-ΔΔCT法計算目標基因的相對表達水平，所檢測指標的具體引物序列詳見表1。(11)蛋白印跡：使用RIPA裂解液卵巢組織，經BCA法測定總蛋白濃度，按每組50μg總蛋白的標準進行SDS-PAGE凝膠電泳后，將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，經脫脂奶粉封閉后采用相應1∶1000稀釋后的一抗4℃孵育過夜，而后經相應1∶2000辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1h后，加入ECL發光液，使用凝膠成像系統進行放射自顯影檢測。

表1 引物序列

3.統計學方法：采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理分析，滿足正態分布的多組間差異采用單因素ANOVA分析中的Bonferroni或Dunnett′sT3進行校正，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠排卵功能及卵巢細胞活力的影響:模型組卵巢卵泡數較對照組增多。模型組單個視野下的平均卵泡數顯著高于對照組，但黃體數目顯著降低(圖1A)。中藥治療組單個視野內的平均卵泡數較模型組有所下降，但差異無統計學意義。中藥治療組單個視野下的平均黃體數目較模型組顯著上升。超數排卵后，模型組大鼠獲卵數顯著低于對照組；中藥治療組獲卵數顯著高于模型組，shRNA注射組的獲卵數顯著低于中藥治療組(圖1B)。但在TUNEL染色的結果中并沒有發現各組TUNEL陽性細胞核的密度的明顯不同(圖2A)。

圖2 卵巢組織TUNEL染色結果(×200)

2.蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠激素水平及甾體激素合成酶表達水平的影響:模型組大鼠的血清T水平顯著高于對照組，但P水平顯著降低。中藥治療組血清T水平顯著低于模型組，但P及E2的水平差異無統計學意義。shRNA注射組血清T水平較中藥治療組顯著上升(圖3A)。與對照組比較，HSD3β、CYP17a1及STAR的mRNA表達水平在模型組卵巢組織中顯著上升；與模型組比較，HSD3β、CYP17a1及STAR基因mRNA的表達水平在中藥治療組卵巢組織中顯著降低。而shRNA注射組卵巢組織CYP17a1的mRNA水平較中藥治療組顯著提高(圖3B)。

圖3 大鼠血清甾體激素水平及卵巢組織甾體激素合成酶表達水平

3.蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠卵巢mTOR表達及顆粒細胞線粒體活性的影響:在各組大鼠卵巢組織的冷凍切片中都觀察到了GFP，慢病毒包被的載體在卵巢組織中能夠穩定表達(圖4A)。模型組中mTOR因子的紅色熒光的強度明顯低于對照組，中藥治療組中mTOR信號強度較模型組顯著提高，shRNA注射組中mTOR的紅色熒光強度則較中藥治療組明顯降低 (圖4B)。代表線粒體活力的紅色熒光在模型組大鼠的顆粒細胞中與對照組比較明顯減弱。中藥治療組卵巢顆粒細胞的線粒體活性較模型組有所提高，但shRNA注射組的熒光強度較中藥治療組明顯減弱(圖4C)。

圖4 鼠卵巢組織免疫熒光染色及卵巢顆粒細胞活性線粒體檢測

4.蒼附導痰湯對線粒體動力學平衡相關因子表達及線粒體聚集狀態的影響:模型組卵巢組織中P110、AKT蛋白表達水平較對照組顯著降低，mTOR及Drp-1的蛋白表達水平也隨之降低；中藥治療組P110、AKT、mTOR、Drp-1蛋白表達水平較模型組均明顯上升。shRNA注射組P110、AKT蛋白的表達水平與中藥治療組差異不明顯，但Drp-1蛋白的表達水平明顯降低(圖5)。對照組大鼠顆粒細胞內線粒體呈現連續的網狀分布，而模型組線粒體聚集程度增強；中藥治療組線粒體分布較模型組有趨向網狀態分布的趨勢，但shRNA注射組細胞內的線粒體仍表現為聚集程度增強的分布狀態(圖6)。

圖5 卵巢組織關鍵因子蛋白表達

圖6 卵巢顆粒細胞TOM20免疫熒光染色(×1600)

討 論

1.蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠卵巢功能的影響依賴于mTOR的表達:肥胖、月經不調、稀發排卵與無排卵是PCOS患者臨床的典型特征[8]。本研究中，PCOS模型大鼠卵巢內卵泡的密度較對照組顯著增加，但超數排卵后的獲卵數顯著降低，說明PCOS模型大鼠卵巢可能對促性腺激素的敏感度降低。蒼附導痰湯灌胃治療雖然沒有明顯改變PCOS模型大鼠的卵泡密度，但顯著增加了黃體密度，提示中藥治療很可能提高模型大鼠的排卵率。研究表明，蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠AKT/mTOR通路具有調節作用[6]。而本研究中，蒼附導痰湯提高PCOS模型大鼠超排后排卵數的效果被mTOR基因的shRNA所抑制，說明中藥調節卵巢功能的藥效作用依賴于mTOR因子的表達。而mTOR的shRNA能夠抑制蒼附導痰湯對模型大鼠血清T水平及卵巢CYP17a1的mRNA表達的藥效作用，也說明mTOR在蒼附導痰湯調節卵巢雄激素分泌途徑中的關鍵作用。

2.蒼附導痰湯治療PCOS模型大鼠表型的藥效作用可能與線粒體功能的調節有關:PCOS患者不僅具有生殖功能的異常，還往往伴隨有代謝功能的異常[9]。雖然PI3K、MAPK等經典的胰島素代謝信號通路被證明與PCOS病因之間密切相關，但目前仍未找到代謝途徑異常導致PCOS的直接證據[10]。線粒體即是細胞合成能量物質的場所也是參與甾體激素合成的細胞色素的主要分布場所，線粒體功能的異常很可能同時導致代謝的異常及甾體激素合成的紊亂[11]。mTOR是PI3K通路中受AKT磷酸化調控的細胞因子，并能通過提高線粒體分裂調控因子Drp-1的磷酸化促進線粒體的分裂[12]。研究表明，在PCOS患者卵巢顆粒細胞中mTOR的蛋白表達水平呈現降低的趨勢[13]。本研究中PCOS模型大鼠卵巢組織中mTOR蛋白的表達水平較對照組顯著下降，同時伴隨著線粒體總活力的降低。蒼附導痰湯治療能夠提升模型動物卵巢mTOR的表達水平及卵巢顆粒細胞中線粒體的活性，提示著在卵巢組織中，胰島素信號通路與線粒體功能之間存在著密切的聯系。而多個對胰島素增敏劑作用機制的研究也證實，線粒體功能的改善可能是某些胰島素增敏劑及代謝調節藥物發揮藥效作用的潛在機制[14,15]。

3.蒼附導痰湯的藥效機制可能與線粒體動力學平衡有關：在正常細胞中線粒體相互融合形成網狀或管狀結構來發揮正常的功能[14]。PCOS患者顆粒細胞中線粒體的分布態勢也與正常人群存在著顯著差異，預示著PCOS患者卵巢細胞的線粒體動力學平衡已經發生了改變[13]。線粒體分裂由細胞核編碼的Drp-1因子調控，是線粒體清除受損脂膜及突變mtDNA的重要機制[16]。本研究中，PCOS模型大鼠卵巢細胞中Drp-1的表達水平降低，且顆粒細胞中線粒體的集聚狀態與對照組比較，差異有統計學意義，提示模型大鼠的線粒體動力學平衡可能發生了變化。而mTOR因子的shRNA抑制蒼附導痰湯提高線粒體分裂相關因子蛋白表達水平及改善顆粒細胞內線粒體的異常集聚狀態的研究結果則表明，mTOR是蒼附導痰湯調節PCOS模型大鼠卵巢細胞線粒體分裂機制的關鍵因子，胰島素信號通路活性的變化很可能通過影響mTOR的活性進而對卵巢細胞的線粒體功能產生影響。

綜上所述，蒼附導痰湯對PCOS模型大鼠血清T水平異常及排卵功能異常有明確的治療作用，其藥效機制很可能與其對線粒體功能的調節有關。mTOR是蒼附導痰湯發揮治療作用的關鍵因子。而mTOR既是胰島素信號通路PI3K的下游關鍵因子，也是調節線粒體分裂的重要因子，提示卵巢顆粒細胞內線粒體活性及功能的變化很可能是連接細胞代謝與內分泌功能變化的關鍵節點。而在PCOS患者體內存在的代謝綜合征等異常病理表現是否會通過影響卵巢細胞線粒體功能，進而對生殖功能造成影響，還有待于開展深入研究。