下調lncRNA CTC-425F1.4靶向調控miR-146a-3p表達對膀胱癌細胞的增殖和侵襲的影響

楊金輝 郝彤彤 楊凌博 康延杰 李小輝 魏澎濤 孫建濤

膀胱癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤，具有易轉移和易復發的特點，患者預后往往較差[1]。研究表明，惡性增殖和侵襲是膀胱癌發展的主要原因[2]。研究膀胱癌惡性進展的具體機制是尋找有效治療靶點的基礎。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)在不同類型細胞中發揮的功能不同，參與調節細胞的運動、脂代謝、糖代謝、免疫等生理和病理進程[3～5]。近年來研究顯示，lncRNA與膀胱癌的惡性進展顯著相關，參與調節膀胱癌細胞的惡性增殖和侵襲，研究lncRNA在膀胱癌中的功能對膀胱癌的靶向治療具有重要意義[6～8]。CTC-425F1.4長度為270個核苷酸，是一個全新的lncRNA，目前對于CTC-425F1.4在腫瘤細胞中的作用尚不明確。本研究旨在探討膀胱癌組織和細胞株中CTC-425F1.4的表達，觀察下調CTC-425F1.4對膀胱癌細胞增殖和侵襲的影響及探討其靶向調控機制，為CTC-425F1.4靶向治療膀胱癌提供參考。

材料與方法

1.材料:選取鄭州大學附屬洛陽中心醫院泌尿外科2018年1月～2021年5月手術切除的膀胱癌組織及對應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5cm)，患者術前均未接受過免疫治療、放療、內分泌治療、化療等抗腫瘤治療。所有納入研究的組織標本均經病理檢查確診。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理審批號：LWLL-2021-07-15)，患者均已簽署知情同意書。Transwell小室購自美國康寧公司。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。膀胱癌細胞UM-UC-3、T24、RT4、5637和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1購自中國科學院上海細胞庫。CTC-425F1.4抑制劑、陰性對照序列(control)、miR-146a-3p模擬物、陰性模擬物(NC)、野生型WT和突變型MUT熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司。熒光定量PCR試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。CCK-8試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。一抗微管蛋白(α-tubulin)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子21(p21)、E盒結合鋅指蛋白1(Zeb1)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指蛋白(Snail)購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.細胞培養和轉染：于37℃、體積分數為5%的CO2的培養箱中，T24、RT4、5637細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基培養，UM-UC-3、SV-HUC-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。膀胱癌RT4細胞分成inhibitor組和control組，根據LipofectamineTM3000說明書分別轉染CTC-425F1.4抑制劑和陰性對照序列。轉染后32h后，檢測CTC-425F1.4下調效果。

3.熒光實時定量PCR檢測CTC-425F1.4、miR-146a-3p表達差異:在液氮中將膀胱癌組織和癌旁組織研磨成粉末，以TRIzol試劑提取組織和處于對數生長期細胞的總RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度，合成cDNA，建立熒光定量PCR體系。分別以β-actin和U6為內參，采用2-ΔΔCt方法分析CTC-425F1.4和miR-146a-3p表達水平。熒光實時定量PCR引物序列詳見表1。

表1 熒光實時定量PCR引物序列

4.生物信息學方法：生物信息學軟件GEPIA分析CTC-425F1.4在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達差異。生物信息學軟件LncBase Predicted v.2的CTC-425F1.4的靶基因。

5.CCK-8法檢測下調CTC-425F1.4對RT4細胞增殖能力的影響：將inhibitor組和control組以2000個/孔細胞接種在96孔板，分別在培養24、48、72、96、120h后終止培養。每孔加入70μl CCK-8反應液，培養箱內反應2.5h，通過酶聯免疫檢測儀分析每孔在預設波長(490nm)的吸光度(A)值。以A值為縱坐標，時間(h)為橫坐標，繪制RT4細胞生長曲線。

6.Transwell小室法檢測下調CTC-425F1.4對RT4細胞侵襲能力的影響:在Transwell小室加入稀釋后的基質膠溶液，培養箱靜置5h凝固。將inhibitor組和control組以30000個/室細胞接種在上室，下室加入含10%胎牛血清的培養基。培養32h，棉簽擦去未穿小室膜的RT4細胞，將小室在多聚甲醛溶液中固定40min，在0.7%結晶紫溶液中染色40min。通過光學顯微鏡計數(放大倍數100倍)，隨機選取6個視野計算平均數。

7.熒光素酶報告系統鑒定CTC-425F1.4的靶基因:將NC、miR-146a-3p分別同熒光素酶報告載體(WT和MUT)共轉染膀胱癌RT4細胞，WT含有CTC-425F1.4的結合位點，MUT含有突變后的CTC-425F1.4的結合位點。培養箱孵育48h，通過熒光素酶活性測定試劑盒分析各組RT4細胞中的相對熒光素酶活性。

8.Western blot法檢測p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白的表達:磷酸緩沖液洗滌inhibitor組和control組細胞，添加裂解溶液冰上裂解。上樣至10%的SDS-PAGE凝膠，上層膠電壓為80V，下層膠電壓為130V。轉膜電流為290mA，轉膜后的硝酸纖維素膜在封閉液中封閉3h，在一抗反應液中過夜孵育，在辣根過氧化物酶標記的二抗中孵育1.5h。均勻孵育電化學發光試劑，曝光顯影，α-tubulin為內參。

結 果

1.CTC-425F1.4在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達:生物信息學軟件GEPIA分析顯示(圖1)，膀胱癌組織中CTC-425F1.4表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.01)。本研究通過熒光實時定量PCR顯示，詳見圖2，膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4的表達分別為3.21±0.26和1.05±0.15，膀胱癌組織中CTC-425F1.4表達水平明顯明顯高于癌旁組織(P<0.01)。

圖1 GEPIA分析膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4表達水平

圖2 熒光實時定量PCR檢測膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4表達水平

2.CTC-425F1.4在膀胱癌細胞和正常膀胱上皮細胞中的表達:膀胱癌細胞UM-UC-3、T24、RT4、5637和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1中CTC-425F1.4的表達分別為3.63±0.44、5.19±0.67、9.33±1.13、2.51±0.43和1.16±0.16，CTC-425F1.4在膀胱癌細胞株中表達水平顯著高于正常膀胱上皮細胞(P<0.05，圖3)。選用CTC-425F1.4表達最高的RT4細胞做后續實驗。

圖3 CTC-425F1.4在正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達水平與SV-HUC-1細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.各組RT4細胞中CTC-425F1.4的表達:control組和inhibitor組RT4細胞中CTC-425F1.4表達分別為9.52±2.01和1.09±0.36，與control組比較，轉染CTC-425F1.4抑制劑后，inhibitor組CTC-425F1.4表達水平明顯降低(P<0.01)。

4.下調CTC-425F1.4對RT4細胞增殖能力的影響:應用CCK-8法連續120h檢測各組RT4細胞的增殖，與control組比較，從24h起，inhibitor組細胞增殖能力顯著被抑制(P<0.05，圖4)。

圖4 CCK-8檢測各組膀胱癌RT4細胞增殖能力與control組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.下調CTC-425F1.4對RT4細胞侵襲能力的影響:inhibitor組和control組RT4細胞穿膜細胞數分別為36.51±5.13個和88.87±11.39個，表明CTC-425F1.4能夠抑制RT4細胞的侵襲能力(P<0.01，圖5)。

6.CTC-425F1.4靶向結合miR-146a-3p：生物信息學軟件發現CTC-425F1.4與miR-146a-3p存在結合位點，詳見圖6。熒光素酶報告系統鑒定顯示，WT+miR-146a-3p組和WT+NC組相對熒光素酶活性分別為6.11±1.46和1.02±0.25，說明CTC-425F1.4靶向結合miR-146a-3p(P<0.01)。

7.下調CTC-425F1.4對RT4細胞中miR-146a-3p表達的影響：inhibitor組和control組RT4細胞miR-146a-3p的表達分別為6.26±1.08和1.03±0.32， 說明下調CTC-425F1.4可促進miR-146a-3p的表達(P<0.01)。

8.下調CTC-425F1.4對p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白表達的影響：與control組比較，轉染CTC-425F1.4抑制劑后，RT4細胞p21蛋白水平明顯升高，侵襲相關蛋白Zeb1、Vimentin、Snail水平顯著降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白表達水平

討 論

長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是近年來被廣泛研究的非編碼RNA，數千種lncRNA被發現和鑒定[9, 10]。lncRNA是一種新型的基因調節分子，通過識別微小RNA(miRNA)進而調控miRNA表達，影響細胞的各種生物學行為[11,12]。研究顯示，lncRNA與膀胱癌的發生和發展相關，表現類似抑癌基因或癌基因作用[13, 14]。Chen等[15]研究顯示，膀胱癌細胞分泌的外泌體含有lncRNA LNMAT2，其不僅在體外刺激人淋巴管內皮細胞管形成和遷移，也可在體內增強腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移。Xu等[16]研究顯示，lncRNA TINCR在膀胱癌組織和細胞中的表達顯著增加，其高表達與膀胱癌患者的腫瘤轉移和晚期腫瘤、淋巴結、轉移分期以及低生存率有關，lncRNA TINCR表達沉默顯著減少膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Shan等[17]研究顯示，lncRNA MEG3在膀胱癌細胞中表達降低，恢復其表達通過負調節miR-494，抑制UM-UC-3和SW780的增殖并觸發細胞凋亡。目前有關CTC-425F1.4在膀胱癌組織中表達和調節作用機制尚不明確。

本研究顯示，CTC-425F1.4在膀胱癌組織和細胞中的表達顯著增加，這與GEPIA數據庫的研究結果一致，均提示CTC-425F1.4在膀胱癌中表達上調，CTC-425F1.4在膀胱癌中表現類似癌基因的功能。本實驗進一步顯示，下調CTC-425F1.4后的膀胱癌細胞增殖和侵襲能力降低，同時膀胱癌細胞的侵襲相關蛋白表達降低，提示CTC-425F1.4可能通過參與膀胱癌細胞增殖和侵襲介導膀胱癌的進展。

lncRNA通過靶向結合miRNA，影響靶miRNA表達，調控細胞的生物學功能[18]。本研究通過生物信息學軟件LncBase Predicted v.2發現CTC-425F1.4與miR-146a-3p存在結合位點，熒光素酶報告系統鑒定miR-146a-3p受到CTC-425F1.4的靶向結合作用，miR-146a-3p可能是CTC-425F1.4影響膀胱癌進展的重要機制。miR-146a-3p屬于miRNA家族成員之一，其在腫瘤發生和發展中表現類似抑癌基因的功能[19]。miR-146a-3p在去勢抵抗性前列腺癌組織中低表達，能夠顯著抑制去勢抵抗性前列腺癌的進展[20]。研究顯示，miR-146a-3p在膀胱癌組織和細胞株中表達降低，上調miR-146a-3p顯著促進抑癌基因p21的表達，miR-146a-3p具有抗細胞生長和轉移的作用[19]。本研究顯示，下調CTC-425F1.4可以明顯上調miR-146a-3p的表達，同時顯著上調p21蛋白的表達，提示下調CTC-425F1.4通過靶向調控miR-146a-3p參與膀胱癌的進展過程。

綜上所述，CTC-425F1.4在膀胱癌組織中高表達，其在膀胱癌進展中可能發揮癌基因作用，下調CTC-425F1.4明顯抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲，其作用機制與靶向調控miR-146a-3p表達相關。CTC-425F1.4可能作為一種癌基因成為膀胱癌治療的靶點。