基于正交設計的姬松茸母種培養條件優化

張琴,成文競

基于正交設計的姬松茸母種培養條件優化

張琴,成文競*

上海農林職業技術學院, 上海 201699

姬松茸（Murrill）是一種藥食同源食用真菌，其味道鮮美，別具香味，且其子實體內富含多種氨基酸、脂肪、礦物質、纖維素及微量元素等人體必需的營養成分，經常食用還具有提升機體免疫力，延緩衰老等保健功效。本研究以姬松茸母種JS05為試驗材料，考察溫度、光照、pH值和不同培養基對菌絲生長速度的影響，結果表明：24～30 ℃是菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速度較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達到4.6 mm·d-1；當培養基pH值為6時，菌絲的生長速度最高；在黑暗條件下，菌絲的生長速度較高；馬鈴薯培養基比玉米粉培養基更適合菌絲生長。正交試驗結果表明：采用加富培養基在培養溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高；pH值是影響姬松茸母種菌絲生長的最關鍵因素，在母種培養時應著重加以注意。

姬松茸; 菌種培養; 條件優化

隨著生活水平的提高，人們越來越喜愛食用營養豐富，安全性好的菌菇類蔬菜。姬松茸原產巴西，又名巴西菇，是一種藥食同源食用真菌，其味道鮮美，別具香味，且其子實體內富含多種氨基酸、脂肪、礦物質、纖維素及微量元素等人體必需的營養成分，經常食用還具有提升機體免疫力，延緩衰老等保健功效[1-3]。前人對姬松茸的營養價值進行了較多研究，有很多研究都表明從姬松茸中提取的活性物質對腫瘤有一定的防治作用，可以用于研制抗癌藥，能促進免疫細胞增殖，活化產生刺激因子，破壞癌細胞活性，提高身體抗癌能力[4]。作為一種珍稀食藥用菌，姬松茸的發展前景十分廣闊。

姬松茸（Murrill）為真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，是一種草腐型、喜濕、好氧的菌類。其子實體菌蓋呈扁圓形到半球形，菌蓋表面密覆淡褐色至栗褐色纖維狀鱗片，蓋緣有菌幕的碎片；姬松茸菌肉呈白色，菌褶密布離生，菌柄圓柱形中實，菌環白色、膜質，孢子暗褐色橢圓至球形，無芽孔，菌絲沒有鎖狀聯合[5-8]。優良菌種是姬松茸栽培生產的關鍵生產資料，在菌種的繼代培養過程中，常常會出現菌絲生長速度減小，產量下降，抗逆性下降等退化現象，導致后續生產遭受不可避免的損失。前人對姬松茸培養基的篩選進行了一些研究，但尚未系統對姬松茸的培養條件進行優化研究。由于常規姬松茸母種一般采用PDA培養基斜面保藏法，此法雖然具有簡單易行，無需專門的設備，并方便實時觀察菌種生長情況的優點，但存在培養基不適合長期保藏菌種，易導致菌種的正常生理代謝途徑受到抑制，進而導致菌種的變異或者退化的問題[9-12]。因此，優化姬松茸母種的培養條件，避免母種在保存培養的過程中過早地發生退化或者變異的情況，有助于姬松茸生產的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為姬松茸菌株JS05，為本實驗室保存的菌種材料，通過菌株無性分離法（即組織分離法）獲得。供試磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）為天津市化學試劑六廠生產；硫酸鎂（MgSO4·7H2O，分析純）為天津市天河化學試劑廠生產；供試葡萄糖、蔗糖、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等為東北制藥廠生產；供試馬鈴薯和玉米粉等為市售。主要采用的儀器設備有恒溫培養振蕩器、生化培養箱和光照培養箱等。

供試基礎培養基為PDA培養基，其配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH值自然。

1.2 方法

將姬松茸菌株JS05接種到PDA瓊脂培養基，室溫下純化培養。將純化后的菌株在室溫下活化24 h，然后接種到PDA試管斜面培養基，在室溫下恒溫培養。

1.2.1 不同溫度對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養基上，分別在15，18，21，24，27，30，33，36 ℃條件下培養5 d后，考察不同培養溫度對姬松茸菌株生長速度的影響，每個溫度處理設3次重復。

1.2.2 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養基上，設置光照培養箱的光照強度分別為0，5，10，15，20，25，30 lx，培養5 d后調查姬松茸菌絲的生長速度，考察不同光照強度對姬松茸菌絲生長的影響，每個光照強度處理設3次重復。

1.2.3 不同pH值對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養基上，采用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NAOH調節培養基的pH值，設置培養基pH值分別為3，4，5，6，7，8，9和10，考察培養基不同pH值對姬松茸菌絲生長速度的影響，每個pH處理設3次重復。

1.2.4 不同培養基組成對姬松茸菌絲生長的影響 PDA瓊脂培養基的制作方法是將去皮馬鈴薯加水后加熱約30 min，用紗布過濾取得濾液，向濾液加入20 g瓊脂后，加熱攪拌直至瓊脂完全溶解，加水定容至1000 mL。加富PDA培養基的制作方法是將去皮馬鈴薯和麩皮加水后煮沸約30 min，用紗布過濾取得濾液，向濾液中加入20 g瓊脂后，加熱攪拌直至瓊脂完全溶解，最后加水定容至1000 mL。PDA綜合培養基的制作方法是在PDA瓊脂培養基的基礎上，向培養基中加入KH2PO4（2 g）、MgSO4·7H2O(0.5 g)。玉米粉培養基的制作方法是將玉米粉（80 g）、葡萄糖（20 g）、瓊脂（40 g）用2 L水加熱溶解混勻[13]。

將JS05菌株接種到30 mL供試培養基上，26 ℃在黑暗條件下培養5 d后測定菌絲長度，計算菌絲生長速度，考察不同培養基組成對姬松茸菌絲生長的影響，每個培養基處理設3次重復。

1.2.5 正交試驗設計法優化姬松茸母種培養條件根據單因素實驗結果，采用L9（33）正交試驗設計[14]，考察不同培養溫度、pH值和培養基組合對姬松茸母種菌絲生長的影響，優化姬松茸母種培養條件。各因素水平詳見表1。

表 1 L9（33）正交試驗設計因素水平

2 結果與分析

2.1 不同培養溫度對姬松茸菌絲生長的影響

由圖1可知，不同培養溫度條件下，姬松茸菌株的菌絲生長速度不同。24～30 ℃是菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速率較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達到4.6 mm·d-1。當培養溫度小于21 ℃，菌絲生長速度明顯降低，隨著培養溫度的降低，菌絲生長速度逐漸減小，15 ℃時，菌絲的生長速度最小。培養溫度超過33 ℃時，菌絲生長速度明顯降低。

圖1 不同培養溫度對姬松茸菌絲生長的影響

2.2 不同pH值培養基對姬松茸菌絲生長的影響

由圖2可知，隨著培養基pH值的不斷增加，姬松茸菌絲生長速度呈先增加，后降低的變化趨勢。當培養基pH值為6時，菌絲的生長速度最高，達到4.5mm·d-1。pH值小于5，大于7時，菌絲生長速度出現明顯下降。

圖 2 不同pH值對姬松茸菌絲生長的影響

2.3 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響

由圖3可知，在黑暗條件下，姬松茸菌絲生長速度最快，達到4.1 mm?d-1。隨著光照強度的升高，姬松茸菌絲生長量呈逐漸下降的趨勢，當培養光照為30 lx時，姬松茸菌絲的生長速度降到1.2 mm?d-1，僅為黑暗條件下姬松茸菌絲生長速度的29%。

圖3 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響

2.4 不同培養基對姬松茸菌絲生長的影響

由表2可知，在馬鈴薯培養基上姬松茸母種菌絲生長較好，在玉米粉培養基上菌絲生長較弱。在馬鈴薯培養基中，PDA綜合培養基處理的菌絲生長速度最大，菌絲長度最長；加富PDA培養基處理的菌絲生長速度次之，兩者差距并不大。3個馬鈴薯培養基處理的菌落形態均表現為菌絲濃密。

表 2 不同培養基對姬松茸菌絲生長的影響

2.5 姬松茸母種培養條件的正交試驗設計法優化

通過正交試驗設計結果分析可知（表3），姬松茸母種培養的較優條件組合為A2B2C2，即采用加富培養基在培養溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高。不同因素影響大小依次為：B（pH值）＞A（溫度）＞C（培養基）。

表 3 姬松茸母種培養條件的正交試驗結果分析

3 討論與結論

姬松茸是一種適宜生活在高溫、多濕和通風環境中的腐生菌。姬松茸具有杏仁的香味，不僅口感脆嫩，菌柄脆、菌蓋嫩、口感極好，而且其藥用價值和營養價值都極高，尤其是具有較強的抗癌作用，是一種食藥兼用的保健菇。前人研究表明，姬松茸含有至少17種常見的氨基酸，其中人體必需氨基酸占近一半。姬松茸新鮮子實體粗蛋白含量較高（54.32%，以干重計），干制后含量雖略有下降，但差異不大[15]。姬松茸中還含有人體必需的多種常量元素和微量元素，如鈣、鎂、磷和鋅、鐵、錳、銅等[16]。姬松茸提取物（ABE）通過激活ROS/JNK介導的線粒體途徑和抑制核因子活化而誘導人白血病THP-1細胞凋亡[17]。適宜的環境條件是菌種進行正常生理代謝活動、合成特色營養物質、表現菌種優良性狀的必要條件。為了保證獲得優良菌種而進行的母種培養條件的優化實驗，有利于姬松茸母種的母種保存以及原種和后續生產的順利進行。

正交試驗設計是一種適用于對試驗結果有影響的因素較多、考察試驗結果的指標較多或者各因素之間互相有影響的比較復雜的試驗。正交試驗設計法就是用一套規格化的表（正交表）安排多個影響因素試驗的方法，是一種簡單方便、省時省力的科學方法，在農業科學研究中被廣泛應用。史紅鴿等[19]采用正交實驗法優化了香菇母種培養基組成，結果發現細木屑、葡萄糖、瓊脂粉、馬鈴薯是香菇母種培養基的較優組成。謝婷等[20]以香菇“森源16”為試驗材料，以菌絲生物量、菌絲球密度和直徑為評價指標項目，采用正交試驗設計優化了香菇搖瓶液體發酵工藝。嚴燕兵等[13]采用正交試驗設計得出金針菇菌絲體發酵的較優液體培養基組成。鄧超等[14]采用正交試驗優化了茶樹菇深層發酵培養基的組成，促進了茶樹菇多糖產量的提升。

本實驗結果表明，24～30 ℃是姬松茸母種菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速率較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達到4.6 mm?d-1。隨著培養基pH值的不斷增加，姬松茸菌絲生長速度呈先增加，后降低的變化趨勢。當培養基pH值為6時，菌絲的生長速度最高，達到4.5mm·d-1。在黑暗條件下，姬松茸菌絲生長速度較快。馬鈴薯培養基是適合姬松茸母種菌絲生長的較優培養基。正交試驗結果表明，采用加富培養基在培養溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高；pH值是影響姬松茸母種菌絲生長的最關鍵因素，在母種培養時應著重加以注意。

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Culture Conditions ofMurrill by the Orthogonal Test

ZHANG Qin, CHENG Wen-jing*

201699,

Murrill has natural edible and medicinal value. It is a kind of natural probiotics, especially in medicine. It has a good preventive and therapeutic effect on cancer and tumor. In this study, theMurrill strain JS05 was used as material, in order to investigate effects of temperature, illumination intensity, pH value and culture medium on strain growth. The results showed that 24-30 ℃ were suitable toMurrill strain，and the optimal temperature was 27 ℃ with the strain growth rate of 4.6 mm·d-1. The strain growth rate was the highest under the treatment of culture medium pH = 6. The strain grew better in the dark compared to in the light. The JS05 strain grew better in the potato culture media than that in the corn powder culture medium. The results of orthogonal experiment showed that the JS05 strain grew better in enriched PDA culture medium, when the culture temperature was 27 ℃ and the pH value was 6, resulting the maximum strain growth rate. Among the three factors, the pH value was the most important factors related to the growth ofMurrill strain JS05.

Murrill; culture; condition optimum

S646

A

1000-2324(2022)01-0029-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.005

2021-06-05

2021-07-29

上海市“科技創新行動計劃”農業領域項目(20392001300)

張琴(1983-),女,碩士,講師,研究方向：蔬菜專業，植物生理生化方向. E-mail:zhangqin1260810@126.com

Author for correspondence. E-mail:chengwenjing1983@126.com