羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾幼蟲的毒力及生長發育的影響

趙宗祥,王明偉,李蕾,吳俊南,王夢茹,李世廣

羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾幼蟲的毒力及生長發育的影響

趙宗祥,王明偉*,李蕾,吳俊南,王夢茹,李世廣**

安徽農業大學 植物保護學院;作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室, 安徽 合肥 230036

為明確昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的致病力，開展草地貪夜蛾的生物防治，本實驗用不同濃度的羅伯茨綠僵菌AAU-4菌株的孢子懸浮液對草地貪夜蛾2齡幼蟲以浸漬法進行了毒力測定。結果表明，AAU-4菌株對草地貪夜蛾2齡幼蟲具有較強的致病力，濃度為1.0×108孢子/mL的LT50=7.18 d，11 d的累積校正死亡率為(70.37±6.73)%，且對被侵染而未致死的草地貪夜蛾幼蟲體重、體長、化蛹率、成蟲羽化率、產卵量、卵的孵化率等均產生了不同程度的影響，具有明顯的亞致死效應。處理組2齡幼蟲存活至6齡時體重為(0.31±0.01) g，對照組6齡幼蟲體重為(0.44±0.00) g；處理組存活至6齡的幼蟲體長為(3.18±0.04) cm，對照組6齡幼蟲體長為(4.25±0.06) cm；處理組幼蟲的化蛹率僅為(59.00±1.87)%，對照組幼蟲化蛹率高達(91.00±1.00)%；處理組幼蟲存活至蛹的羽化率為(55.80±4.96)%，對照組蛹的羽化率為(91.75±4.96)%；處理組幼蟲存活至成蟲的平均產卵量為(728.80±16.16)個，對照組成蟲的平均產卵量為(951.30±23.29)個；處理組幼蟲存活至成蟲所產卵的校正孵化抑制率為(38.48±2.69)%，而對照組成蟲所產卵未見孵化抑制現象；處理組與對照組間在上述6個指標上均存在顯著性差異。因此，羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾的生長發育及繁殖均具有顯著抑制效果，可以減少下一代的蟲口數量，具有開發為生防制劑應用于草地貪夜蛾綠色防控的潛力。

草地貪夜蛾; 羅伯茨綠僵菌; 毒力測定; 生物防治

草地貪夜蛾(J.E. Smith)，屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，原產地位于美洲熱帶和亞熱帶地區[1]，具有繁殖力強、擴散蔓延速度快的特點[2]。2016年1月入侵非洲地區后，很快蔓延到撒哈拉以南的44個國家[3]，2019年1月入侵中國云南，2020年隨季風向北遷移至長江、黃河流域和東北地區，對我國多地農作物都造成了巨大的影響[4]。

對草地貪夜蛾的防治方法主要包括物理防治、化學防治和生物防治三大類。相較于化學農藥的污染問題，以菌治蟲的生物防治方法更為環保、安全，且蟲生真菌易在自然界中宿存并形成害蟲流行病[5]，對防控草地貪夜蛾具有極大的開發潛力[6]。眾多研究表明：綠僵菌對鱗翅目、直翅目(Orthoptera)、和鞘翅目(Homoptera)等200多種害蟲均有明顯的防治效果，其中包括危害農林作物的小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲、蠐螬、椰心葉甲、蝗蟲、德國小蠊、褐飛虱、松墨天牛等[7]。張柱亭[8]等在黔東南地區發現綠僵菌可侵染各齡期草地貪夜蛾幼蟲。馬艷[9]等在大理大田調查中也發現綠僵菌能在自然條件下侵染各齡期草地貪夜蛾幼蟲，并對3～4齡草地貪夜蛾幼蟲的感染力最高，田間自然感染率為75%，能有效降低草地貪夜蛾對作物產量的影響。

蟲生真菌在害蟲生物防治中應用十分廣泛，對人類、環境和非靶生物的危險性非常低[10]。羅伯茨綠僵菌來源于自然界，其生活方式多樣[11]，可通過多種方式寄生到昆蟲體內。羅伯茨綠僵菌孢子懸浮液的單獨使用雖存在殺蟲作用緩慢等局限性問題，但在整個侵染過程中明顯降低了草地貪夜蛾幼蟲的生活力，并對其正常生長發育造成較大影響。本實驗評價了不同濃度AAU-4分生孢子懸浮液對草地貪夜蛾2齡幼蟲的毒力及生長發育和繁殖的影響，為后期開展羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾致病機理研究并將其開發為生物制劑應用于草地貪夜蛾綠色防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株羅伯茨綠僵菌AAU-4由安徽農業大學作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室提供。

1.1.2 供試蟲源草地貪夜蛾蟲源采自安徽農業大學大楊店鎮實訓基地未噴藥的玉米田中，用安徽農業大學植物保護學院溫室中未噴藥的非轉基因玉米嫩葉進行飼養，經2代飼養后選取蟲體狀況基本一致的2齡幼蟲進行實驗。

1.1.3 培養基的制備制備SDAY培養基：稱取葡萄糖40 g、瓊脂20 g、蛋白胨10 g和酵母粉10 g，定容1 L，在121 ℃的立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min。

1.1.4 供試藥劑與儀器0.05% Tween-80(西隴化工股份有限公司)、瓊脂(國藥公司)、葡糖糖(國藥公司)、恒溫培養箱(上海智誠)、漩渦震蕩器(江蘇金壇國勝)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)、超凈工作臺(蘇州凈化)、電子顯微鏡(Nikon)、電子天平(上海METTLER TOLEDO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液的配制刮取成熟的羅伯茨綠僵菌AAU-4分生孢子，并在0.05% Tween-80水溶液中進行溶解，在顯微鏡下采取血球計數板計數的方法，配制1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL濃度的孢子懸浮液。

1.2.2 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液對草地貪夜蛾2齡幼蟲的毒力測定參照1.2.1 所述方法配置4個濃度梯度的孢子懸浮液，每濃度梯度設置3組重復，每組選取20頭生長狀態基本一致的2齡幼蟲，在各梯度孢子懸浮液中浸漬10 s，設置0.05% Tween-80水溶液作為空白對照組(CK)。在室溫為(25±2) ℃、相對濕度(75±5) %、L:D=12 h:12 h 的養蟲室中進行飼養，每24 h統計幼蟲死亡數量一次。

1.2.3 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液對草地貪夜蛾生長發育及繁殖的影響按1.2.1中所述方法配制4個濃度梯度的孢子懸浮液，每組處理20只2齡幼蟲，每組重復3次，設置0.05% Tween-80水溶液作為空白對照組。供試蟲體的處理方式和飼養環境同1.2.2，每24 h記錄草地貪夜蛾的生長變化狀態：蟲體重量、長度、蛹重、化蛹率、羽化率及其產卵量和卵的孵化率。及時清理廢棄物，更換飼料。對羽化出的草地貪夜蛾成蟲，飼喂其濃度為10%的蜂蜜水，以保證成蟲期的營養補充。

1.3 數據處理與統計分析

孵化率(%)=(孵化卵數/處理總卵數)× 100

孵化抑制率(%) =(未孵化卵數/處理總卵數)×100

校正孵化抑制率(%) = [(處理組孵化抑制率-對照組孵化抑制率)/(1-對照組孵化抑制率)]×100

死亡率(%)＝(處理組死亡總蟲數/處理組總蟲數)×100

校正死亡率(%)＝[(處理組死亡率-對照組死亡率) / (1-對照組死亡率)]×100。

實驗數據的分析與處理采用采用Excle 2007和DPS 9.5版本，計算校正孵化抑制率、累計校正死亡率、毒力回歸方程、相關系數、LT50、卡方值及95%置信限，其余數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液對草地貪夜蛾2齡幼蟲的毒力

由表1可知，羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾2齡幼蟲的毒力隨著孢子懸浮液濃度的增加而增加，最低濃度1.0×105孢子/mL的累積校正死亡率不及20%，最高濃度1.0×108孢子/mL對幼蟲的累計校正死亡率達到了(70.37±6.73)%，且毒力回歸方程為=3.1462+2.1654。低濃度與高濃度孢子懸浮液處理的草地貪夜蛾幼蟲累積校正死亡率間存在顯著性差異。

表 1 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液對草地貪夜蛾2齡幼蟲的毒力

注：表中數據為平均值±標準誤，同列不同小寫字母表示采用Duncan's新復極差統計法進行比較，差異顯著(<0.05)。下同。

Note: The data in the table were mean ± SE. Different letters in each column indicated significant difference (<0.05) by Duncan's multiple range tests. The same as follows.

2.2 羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾2齡幼蟲蟲體外部形態的影響

實驗表明，被菌株AAU-4侵染的草地貪夜蛾2齡幼蟲與對照組相比，其蟲體外部形態在侵染初期無明顯變化，幼蟲在取食量和活動力方面均有所降低，但較對照組不明顯。隨著蟲齡的增加，幼蟲開始出現明顯顫搐和拒食的現象，存活至6齡的幼蟲在體表顏色(圖B、圖D)、蟲體重量(表2)和蟲體長度(圖H、表3)上與對照組均存在顯著性差異。以1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液侵染但未死亡的6齡幼蟲為例：CK對照組中長至6齡的蟲體重量和長度分為(0.44±0.00) g和(4.25±0.06) cm，經1.0×108孢子懸浮液處理的長至6齡的草地貪夜蛾幼蟲體重和體長分別為(0.3131±0.01) g和(3.18±0.04) cm。同時，處理組的幼蟲在5、6齡時蟲體畸形的情況也逐步增多。實驗中受侵染的蟲體腹部的不同位置呈白色透明狀，前胸背板等部位發黑且身體僵硬(圖D、圖E)，被侵染死亡后，蟲體表面開始出現明顯菌絲，分生孢子逐步覆蓋在草地貪夜蛾蟲體表面(圖F)。

圖 1 AAU-4對草地貪夜蛾生長發育的影響

A(背部) 經0.05% Tween-80水溶液處理存活至6齡的對照組幼蟲

B(背部) 經1.0×107孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液處理存活至6齡的草地貪夜蛾幼蟲

C (側面) 經0.05% Tween-80水溶液處理存活至6齡的對照組幼蟲

D (側面) 1.0×107孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染存活至6齡的草地貪夜蛾幼蟲

E 1.0×108孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染存活至6齡的草地貪夜蛾幼蟲

F 經1.0×108孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染形成的草地貪夜蛾僵蟲

G 經0.05% Tween-80水溶液處理的對照組幼蟲

H 經1.0×107孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液處理對存活至6齡的草地貪夜蛾幼蟲體重、長度的影響

I 經0.05% Tween-80 水溶液處理的對照組幼蟲所化的蛹形態正常

J 經1.0×108孢子/mL羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液處理的草地貪夜蛾幼蟲所化的蛹變為畸形

表 2 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染存活至5、6齡的草地貪夜蛾幼蟲體重的變化

表 3 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染存活至5、6齡的草地貪夜蛾幼蟲體長的變化

2.3 羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾化蛹率的影響

經1.2.2中處理的草地貪夜蛾2齡幼蟲在藥后11 d開始陸續化蛹，如表4可知，對照組的化蛹率為(91.00±1.00)%，羽化率為(91.75±1.31)%，而經1.0×108孢子/mL孢子懸浮液侵染的2齡幼蟲的化蛹率和羽化率僅為(59.00±1.87)%和(55.80±4.96)%。經1.0×106和1.0×107孢子/mL孢子懸浮液侵染的幼蟲化蛹率和成蟲羽化率差異不明顯，但經處理的幼蟲中出現了大量的畸形蛹(圖J)。

表 4 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染對草地貪夜蛾化蛹率和羽化率的影響

Table 3 Effects of Metarhizium robertsiis AAU-4 spore suspension on pupal weight, pupation rate and emergence rate of Spodoptera frugiperda

2.4 羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾成蟲產卵量、卵的孵化率的影響

經1.0×108孢子/mL孢子懸浮液侵染的2齡幼蟲，其成蟲平均產卵量為728.80個，與對照組及低濃度處理間存在顯著性差異。不同濃度孢子懸浮液侵染的校正孵化抑制率最高為(38.48±2.69)%，最低為(10.92±1.92)%，由表5可明顯看出，隨著孢子懸浮液濃度的增加，低濃度和高濃度處理的校正孵化率上具有顯著性差異。

表 5 羅伯茨綠僵菌AAU-4孢子懸浮液侵染對草地貪夜蛾產卵量和卵的孵化率的影響

3 討 論

羅伯茨綠僵菌來源于自然，生活方式多樣，易在自然界中宿存并形成害蟲流行病[11]，可以通過多種侵染方式侵染各類口器害蟲并在害蟲體表或體內進行寄生[12]，從而殺死害蟲，達到較好的防治效果。鄭亞強[13]等發現，1.0×108個/mL孢子濃度的萊氏綠僵菌孢子懸浮液對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率達100%。雷妍圓[14]等同樣發現，1.0×109孢子/mL的綠僵菌對草地貪夜蛾2齡幼蟲7 d的累計校正死亡率達100%，LT50僅為3.030 d。Akutse等[15]用20株昆蟲病原真菌(綠僵菌14株和球孢白僵菌6株)對草地貪夜蛾進行了毒力測定，結果發現所選取的菌株僅對卵的孵化和1、2齡幼蟲具有較好防效，部分真菌藥劑對高齡草地貪夜蛾幼蟲的防治效果不理想[16,17]。本次實驗采用浸漬法對草地貪夜蛾2齡幼蟲進行了毒力測定[15]，結果表明，在處理后第11 d，1.0×108孢子/mL的羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾2齡幼蟲最高累積校正死亡率為(70.37±6.73a)%，相較于Thomazoni等[18]對草地貪夜蛾3齡幼蟲實驗中的最高致死率44.5%，已有顯著性提升。1.0×108孢子/mL濃度的AAU-4對草地貪夜蛾2齡幼蟲的LT50為7.18 d，而陳自宏等[19]實驗中測得的13株白僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的LT50在2.3 d ～10.3 d之間。以上研究表明，AAU-4對草地貪夜蛾2齡幼蟲具有較強的致病力。AAU-4雖不能迅速將草地貪夜蛾幼蟲致死，但該菌株在草地貪夜蛾幼蟲的生長發育和成蟲繁殖力上的影響同樣也是評價該菌對草地貪夜蛾防治效果的依據之一[20]。在毒力測定實驗中，觀察到經AAU-4侵染后，草地貪夜蛾幼蟲5、6齡時的蟲體重量、長度、化蛹率、羽化率及其成蟲的產卵量與卵的孵化率均顯著低于對照組。產生該現象的主要原因可能是AAU-4菌株侵染并在草地貪夜蛾體表或體內定殖發育的過程中消耗了蟲體大量的養分，且菌株生長過程中產生的次生代謝產物對草地貪夜蛾幼蟲的神經、消化系統產生了不同程度影響[21]，降低了草地貪夜蛾的生活力和取食量，從而導致幼蟲在菌株處理后期產生明顯顫搐和畸形的現象產生[16,22]。本實驗發現，被AAU-4菌株侵染后期的幼蟲體表發黑，這與彭國雄[23]等的研究發現一致。實驗中死亡的蟲體，在不保濕處理的情況下蟲體表面極少會自然產生菌絲，這與龍秀珍[24]等發現的萊氏綠僵菌侵染草地貪夜蛾幼蟲的研究結果類似。綜上，本實驗研究結果表明羅伯茨綠僵菌AAU-4具有開發為生防制劑應用于草地貪夜蛾綠色防控的潛能。

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Virulence and Effects ofAAU-4 on the Growth and Development of Larvae of

ZhAO Zong-xiang, WANG Ming-wei*, LI Lei, WU Jun-nan, WANG Meng-ru, LI Shi-guang**

230036,

In order to clarify the virulence of entomopathogenic fungi againstand carry out biological control of, the virulence ofAAU-4 conidial suspensions to the 2nd instar larvae ofwas determined. The results showed that AAU-4 had a strong virulence to the 2nd instar larvae. The LT50was 7.18 d at 1.0×108conidia/mL, and the cumulative adjusted mortality was (70.37±6.73)% at 11 d. In addition, it had obvious effects on the body weight, body length, pupation rate of the infected larvae, adult emergence rate, oviposition quantity and the egg hatching rate of the treatment group. The body weight of the 2nd instar larvae in the treatment group was (0.31±0.01) g, and that of the 6th instar larvae in the control group was (0.44±0.00) g. The body length of the 6 instar larvae in the treatment group was (3.18±0.04) cm, and that in the control group was (4.25±0.06) cm. The rate of pupation was only (59.00±1.87)% in the treatment group and (91.00±1.00)% in the control group. The emergence rate was (55.80±4.96)% in the treatment group and 91.75±4.96)% in the control group. The average number of eggs laid in the treatment group was (728.80±16.16), and 951.30±23.29) in the control group. The corrected hatching inhibition rate of the eggs laid by the adult developed from the larvae in treatment group was (38.48±2.69)%, and that of the eggs laid by the adults in control group was 0. There were significant differences between the treatment group and the control group in the above six indicators. Therefore,AAU-4 has a significant inhibitory effect on the growth, development and reproduction of, and can reduce the population number of the next generation of, which has the potential of developing biological control agents for the green control of.

;; toxicity measurement; biological control

S476+.12

A

1000-2324(2022)01-0060-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.010

2021-10-11

2021-11-04

安徽省自然科學基金(1908085MC94)

趙宗祥(1995-),男,碩士研究生,主要從事有害生物綠色防控等研究. E-mail:1215344921@qq.com

王明偉(1998-),本科生,專業方向:植物保護. E-mail:430857572@qq.com

Author for correspondence. E-mail:lsg815@163.com