山東省黑松枯萎病病原鑒定、致病性及其生長適應性研究

呂娟,亓玉昆,季延平,張宗俠,趙海燕,劉慇,韓鳳英,王清海*

山東省黑松枯萎病病原鑒定、致病性及其生長適應性研究

呂娟1,2,亓玉昆2,季延平2,張宗俠1,趙海燕3,劉慇2,韓鳳英4,王清海2*

1. 濟南市園林和林業科學研究院, 山東 濟南 250103 2. 山東省林業科學研究院, 山東 濟南 250014 3. 青島市城陽區自然資源局, 山東 青島 266109 4. 山東農業工程學院, 山東 濟南 251100

為明確黑松枯萎病病原菌種類及其生物學特性，采用組織分離法和單孢分離法對其分離純化，通過形態學、多基因系統發育分析對其鑒定，利用活體接種法測定其致病性，并探討不同培養基類型、溫度、pH、光照等處理條件下菌絲生長速率，確定其適宜生長條件。結果表明，引起黑松萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌（）。該病原菌適宜生長溫度為25 °C～30 °C，25 °C為最適溫度；最適pH為5.0-10.0；PDA培養基和PSA培養基最適菌絲生長，持續光照、持續黑暗以及光照12 h:黑暗12 h處理對菌絲生長無顯著性影響。

黑松枯萎病; 病原鑒定; 致病性

松樹（）是一種重要的優質用材樹以及荒山綠化的先鋒樹種，在水土保持、涵養水源和防風固沙等方面發揮著重要作用。然而，松樹在生長季節中易受到多種生物因素（比如松材線蟲、病原真菌、日本松干蚧等）的危害，導致松針失綠，整株枯萎。其中松材線蟲現階段給我國松林帶來重大危害及威脅[1]，是近幾十年來我國發生最嚴重、最危險的重大林業病害[2]。除此之外，松針褐斑病（）[3]、松枝枯病（）[4]、松枯梢病（）[5]、松落針病（spp.）[6]、日本松干蚧[7]等也在不同時期、不同地域，造成松林大面積枯死。

山東省松林資源400,200多萬m2，以生態公益林為主，主要為黑松（）、赤松（），絕大多數為上世紀50-60年代栽植，樹齡老化，加之近幾年持續干旱以及冬春季異常低溫，導致松樹樹勢衰弱[4]。2019年10月下旬以來，在山東省沿海地區松林陸續出現松針失綠、變色枯萎，發病速度快，嚴重時整株枯死，造成松樹大面積死亡。僅2019年12月至2020年2月青島市松樹枯死數量從50 332株增加至161 547株，經取樣鏡檢鑒定松林，僅在少量松材線蟲病疫情小班松林中發現松材線蟲，排除該松樹枯萎病是松材線蟲侵染引起[8]。在松針失綠干枯部位，病征不明顯。因此，為明確黑松枯萎的致病因子，本研究從染病的黑松上分離具有枯萎病典型癥狀的菌株，通過形態特征、多基因系統發育分析對其進行鑒定，并初步探究其生長適應性，為該病害的發生、流行規律及其防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020年3月，從山東省青島市城陽區丹山采集整棵剛感病，尚未完全枯死的黑松（=5 cm，=1.8 m），針葉已經開始失綠，松針灰白色。將整棵樹全部采集，從基部開始每隔20 cm，切段，從松樹頂端開始樣本進行編號，共分為9段，帶回實驗室放在4 ℃的冰箱里保存備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化采用組織分離法。將采集每段樣品，主干側枝部位切成0.5 cm厚的圓盤，然后剪成3～4 mm2的組織塊，松針剪成5 mm松針段。樣品先用70%乙醇溶液浸泡1 min，然后再用1%次氯酸鈉溶液處理1 min，最后無菌水沖洗3次。每個PDA培養基平板上放置3塊，25 ℃培養5 d。挑取單個菌落，轉移到新的PDA平板中，25 ℃培養7 d，采用稀釋法進行單孢純化。將單菌落菌株移置于PDA斜面試管中培養，4 ℃保存。所有菌株均保存于山東省林業科學研究院森林保護研究所。

1.2.2致病性測定采用活體接種法。選用了健康無病的1年生黑松苗，進行盆栽，栽培所用土壤在121 ℃條件下濕熱滅菌2 h，自然冷卻后，進行盆栽。將盆栽后的黑松苗置于室外管理，60 d后，選擇20棵健康無病、生長一致的黑松苗進行致病性試驗。將分離純化的菌株在PDA平板上培養5 d，在菌落邊緣用打孔器制作菌餅（= 5 mm），以空白PDA培養基為對照。選擇在陰天的下午，用無菌的手術刀在黑松苗干基部切成“T”型傷口，每個傷口接種1片菌餅，以接種空白PDA培養基為對照。在接種傷口處放置無菌水脫脂棉球進行保濕，用封口膜包裹固定。處理和對照各接種10棵黑松苗。將處理后的盆栽黑松苗至于室外進行澆水、除草等日常管護，觀察記錄。

1.2.3形態學鑒定 將純化后的菌株接種在PDA平板上培養5 d后，在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅（= 5 mm），將菌餅置于PDA平板中央，每個平板置1塊菌餅，25 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養5 d，觀察記錄菌落特征。記錄菌落正面、背面顏色、菌落邊緣形狀、均勻度，菌落質地。置于25 ℃的黑暗培養，待平板中長出子實體后，用挑針挑取少許，制作臨時玻片，在光學顯微鏡下觀察分生孢子形態，利用Qimaging拍照系統拍照。隨機選取50個孢子，利用cellSens軟件測量其大小。

1.2.4 分子鑒定采用改進的CTAB法進行提取DNA，選擇的目的基因分別為核糖體轉錄間隔區序列（rDNA internal transcribed spacer，ITS）、翻譯延伸因子- 1 α ( Partial Translation Elongation Factor-1α，)[9,10]進行擴增。擴增引物參考表1。反應體系：25 μL，包括Taq酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL，DNA模板3 μL。PCR產物由上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

表 1 PCR擴增所用引物及反應程序

將ITS、序列提交到GenBank數據庫中，基因編號見表2。將獲得的序列在NCBI數據庫進行比對。選取24株sp.參考菌株，以（菌株編號為ASHCAn）為外圍菌株，運行MEGA 7.0軟件中Clustal W對基因序列比對，然后利用Fasta alignment joiner軟件通過首尾相連的方法，將 ITS、基因串聯。利用MEGA 7.0軟件，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建多基因系統發育樹，循環1000次，并以自展率（Bootstrap）校對檢測。

表 2 用于系統發育分析的參考菌株序列

*表示的是研究菌株。

*Strains collected in the present study.

1.2.5不同培養基對病原菌菌絲生長的影響在PDA培養基、PMA培養基、玉米粉瓊脂培養基CMA、PSA培養基、燕麥片培養基OA、沙氏培養基SDA和馬丁氏培養基Martin等培養基平板上，接種生長一致的病原菌菌餅（= 5 mm），25 ℃培養，每天16:00采用十字交叉法測量菌落直徑，待有菌絲全部長滿平板時，停止記錄，計算菌絲生長速率。每個試驗處理重復3次，平行測定4次。菌絲生長速率計算公式如下：菌絲生長速率=（菌落直徑-初始菌餅直徑）/培養天數。

1.2.6 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響取生長一致的病原菌菌餅（= 5 mm）接種到PDA平板中，分別放置于10、15、20、25、30、35 ℃等6個溫度梯度恒溫培養箱內，黑暗培養，測量記錄方法同1.2.5。

1.2.7 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響以PDA培養基為基礎培養基，用1 mol/HCL和1 mol/NaOH溶液，分別將培養基pH值調制為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共7個處理。在無菌條件下，取直徑5 mm菌餅分別接種至不同pH的PDA平板中央，25 ℃黑暗培養，測量記錄方法同1.2.5。

1.2.8 不同光照對病原菌菌絲生長的影響生長一致的病原菌菌餅（= 5 mm）接種到PDA平板中，設置光照24 h、黑白交替12 h、黑暗24 h等3個光照條件處理，25 ℃培養，測量記錄方法同1.2.5。

1.2.9 數據分析處理試驗數據利用spss 20.0進行數據分析，差異顯著性分析采用采用LSD比較法。

2 結果與分析

2.1 黑松枯萎病癥狀

發病初期，黑松松針逐漸失綠，呈灰白色，隨著病情擴展，后期松針變為黃褐色，干枯，易脫落，部分黑松存留少量綠色松枝，發病嚴重的整株枯死（圖1）。松針變色從松針針尖向針鞘逐步擴展，但在松針上未見明顯病斑癥狀及子實體。剛枯死的黑松木材新鮮濕潤，有少量松脂滲出。

圖 1 黑松枯萎病田間癥狀

2.2 分離菌株致病性測定

采取活體盆栽接種法，30 d后，接種的10棵黑松中有8棵在接種點附近出現黑色斑點，后期形成黑色子實體；初期頂端松針失水干枯，下方松針隨后干枯，最終整株枯萎死亡（如圖2），致死率為80%。而空白對照未發現枯萎癥狀，對接種后發病的植株部位進行分離，獲得的菌株與接種菌株一致。

圖 2 致病性試驗

(A) 黑松苗接種30 d后癥狀, (B) 接種部位癥狀, (C) 對照

(A) symptoms onseedlings (2-years old) inoculated with isolate S81 for 30 days; (B) symptoms on inoculation sites; (C) CK

2.3 病原菌形態特征觀察

菌株S81在PDA培養基25 ℃黑暗環境下培養10 d后，菌落白色、淡粉色或淡紫色，邊緣整齊，氣生菌絲較發達，菌落呈棉花狀，菌落厚重；背面呈紫紅色（如圖3）。在光學顯微鏡下可以看到2種類型的孢子，分別是小型分生孢子和厚垣孢子。小型分生孢子呈橢圓形或長卵圓形，分生孢子大小為13.0 ± 2.9 × 3.8 ± 0.5 μm（＝50），具1-2個隔膜；厚垣孢子呈球形或近球形（如圖3）。其菌落形態特征、分生孢子形狀、大小符合鐮刀菌屬（sp.）特征描述。

圖 3 S81菌株菌落形態

(A)菌落形態, (B)-(C) 子實體, (D) 分生孢子

(A) cultural character; (B) acervulus; (C) conidia

2.4 病原菌分子鑒定結果

將獲得的S81菌株與24株參考菌株的ITS、基因序列進行比對，以（菌株編號為ASHCAn）作為外圍菌株，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建多基因系統發育樹。系統發育樹最高對數似然值為-3061.43。菌株S81與6株參考菌株聚在同一分支上，自展率為99%（圖4）。

因此根據形態學與多基因分子序列分析，本次分離獲得的菌株為尖孢鐮刀菌（）。

圖 4 利用最大似然法基于黑松枯萎病菌ITS和tef-1的基因數據構建的系統發育樹。自展率標于節點處，所用模式菌株由粗體表示，以Aspergillus niger為外圍菌株，標尺指示0.05步變化。

2.5 不同培養基對菌絲生長的影響

由圖5可以看出，S81菌株在不同的培養基上菌絲生長速率不同。在PDA和PSA培養基上生長最好，菌絲生長速率為1.22 ± 0.11 cm/d，1.25 ± 0.10 cm/d，明顯高于其它培養基處理，在<0.01水平上具有顯著性差異。SDA和CMA培養基不適宜菌株生長，菌絲生長速率僅為0.92 ± 0.19 cm/d和0.88 ± 0.16 cm/d。

2.6 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

圖6結果表明，不同溫度對S81菌株菌絲生長速率的有著顯著的影響，在溫度25 - 30 ℃時菌絲生長速率最快，可達0.96 ± 0.17 cm/d – 1.07 ± 0.23 cm/d，在溫度為20 ℃時，該菌株的生長速率顯著降低，生長速率為0.75 ± 0.08 cm/d，在溫度低于15 ℃或高于35 ℃時，該菌株生長緩慢或停止生長。

圖 5 不同培養基對S81菌株菌絲生長的影響

圖 6 不同溫度對S81菌株菌絲生長的影響

2.7 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

適宜S81菌株菌絲生長的pH值范圍較廣，在pH 4.0 – 10.0的范圍內菌絲均能生長。在pH 4.0條件下，菌絲生長受到抑制，菌絲生長速率僅為0.40 ± 0.24 cm/d，在pH 5.0 – 10.0之間，菌絲生長速率為0.96 ± 0.07 cm/d -1.08 ± 0.09 cm/d，在0.01水平上無顯著差異（圖7）。

2.8 不同光照對病原菌菌絲生長的影響

圖8結果表明，24 h黑暗、24 h光照以及12 h黑暗:12 h光照等3種處理下，S81菌株菌絲生長速度分別為1.15 ± 0.14 cm/d、1.10 ± 0.12 cm/d、1.13 ± 0.15 cm/d，在< 0.01水平上無顯著性差異。

圖 7 不同pH對S81菌株菌絲生長的影響

圖 8 光照對S81菌株菌絲生長的影響

3 結論與討論

本實驗對山東青島市城陽區丹山感病黑松采樣，分離培養，通過對菌株的its、多基因系統發育分析，結合形態特征、培養性狀，確定分離獲得的菌株為尖孢鐮刀菌（）。通過接種1年生黑松盆栽苗，80%的黑松苗出現與林間相似的枯萎癥狀，表明尖孢鐮刀菌可以引起黑松枯萎死亡。尖孢鐮刀菌是一種土傳植物病原真菌，全球廣泛分布。寄主范圍廣，可侵染100多種具有重要價值的作物，引起寄主植物維管束褐變、葉片失水萎蔫、脫落，植物吸收營養的能力減弱，致使植物死亡，造成嚴重的經濟損失[11]。在種的水平上，尖孢鐮刀菌寄主范圍廣泛，然而，對于單個菌株，其具有明顯的寄主專化性[12,13]，尖孢鐮刀菌具有致病性的至少有150個寄主專化型。由于種內具有相對豐富的生物多樣性，尖孢鐮刀菌能夠在短時間內適應環境變化，形成新的致病菌株[11]。由于其強致病力以及造成的經濟損失，尖孢鐮刀菌是公認的全球第五大植物病原真菌[14]。

引起松樹枯萎的因子有環境因子和生物因子。環境因子中大氣污染、環境氣候（極端天氣）、土壤因素均可以引起松樹干枯死亡。病原線蟲、病害因素、蟲害因素等生物因子中，最主要的是松材線蟲。松材線蟲病可以引起松林大面積死亡，是松樹疫情，是目前松樹枯萎重點考慮因素。除此之外，鐮刀菌屬真菌中有多個種均可以侵染松樹造成松樹死亡。是松屬植物中最重要的病原菌之一，侵染松樹，引起潰瘍病[15]，是重要的檢疫對象。f. sp.在美國加利福尼亞、新西蘭可以侵染輻射松（）[16,17]，在南非侵染展葉松（），引起根腐病[18]。[19,20]、[21]、[22]侵染阿勒頗松（）、北美喬松（）。[23]同樣可以危害阿勒頗松引起猝倒病。也可以侵染意大利石松（）[24]。能夠侵染歐洲赤松（）[25]、北美喬松[19]。可以危害輻射松[17]。，，，，，，，均可以引起北美喬松根腐病[19]。可以侵染多種松屬植物，在哥倫比亞侵染展葉松和紙松（）[26]，在印度可以引起喬松（）根腐病[27]，危害意大利石松[24]，在西班牙引起歐洲赤松猝倒病[25]，在新西蘭危害輻射松[17]。已有的報道表明，在中國尖孢鐮刀菌可以侵染馬尾松，引起猝倒病[28]。本實驗結果證實，同樣可以引起黑松枯萎死亡。明確致病因子是控制病害的重要前提，因此，在中國探討松樹枯萎原因時，鐮刀菌屬真菌尤其是尖孢鐮刀菌是不可忽視的生物因素之一。

溫度、光照和pH是影響菌株生長的重要的環境因子。本試驗測試了溫度、光照以及pH對尖孢鐮刀菌S81菌株菌絲生長速率的影響，結果表明，尖孢鐮刀菌S81對光照、酸堿度具有廣泛的適應性，在pH 5.0 - 10.0范圍內，24 h持續光照、24 h持續黑暗、12 h光照:12 h黑暗等3種光照條件下菌絲生長速率無顯著性影響。溫度對S81菌株菌絲生長具有顯著性影響，最適溫度25 ℃，低于15 ℃，或高于35 ℃，菌絲生長緩慢或停止生長。病害在林間的擴展蔓延與菌株自身的生物學特性緊密相關，摸清其生物學特性，對病害的預測預報及有效防控具有重要意義。本研究結果對于青島市松樹異常枯萎原因診斷分析及針對性防控提供了重要的基礎數據，也為該病害今后的預測預報、防控提供了基礎的理論依據。

[1] 楊寶君.松材線蟲病致病機理的研究進展[J].中國森林病蟲,2002,21(1):27-31,14

[2] 葉建仁.松材線蟲病在中國的流行現狀,防治技術與對策分析[J].林業科學,2019,55(9):1-10

[3] 吳小芹.我國松樹主要針葉病害發生概況及其防治[J].森林病蟲通訊,1993(1):37-41

[4] 姚文生,李占鵬,耿以龍等山東省松枝枯病發生情況調查[J].山東林業科技,2000(2):28-30

[5] 吳小芹.全球松樹枯梢病發生狀況與防治策略[J].世界林業研究,1999(1):16-21

[6] 宋玉雙,何秉章,王福生.我國松落針病研究的新進展[J].森林病蟲通訊,1994(2):42-46

[7] 趙石峰,常國斌,黨中玉.我國日本松干蚧的發生情況和對策[J].林業科技通訊,1990(12):1-3

[8] 孫玉江,張磊,陳香芹,等.青島市松樹異常枯萎調查及處置方法探析[J].河北林業科技,2021(1)::33-37

[9] Le DP, Tran TT, Gregson A,.sequence-based diversity ofspecies recovered from collar rot diseased cotton seedlings in New South Wales, Australia [J]. Australas Plant Pathol., 2020,49:277-284

[10] Wang JP, Zheng CY. Characterization of a newly discoveredisolate toPerganda, a non-native invasive species in China [J]. Microbiol. Res., 2012,167:116-120

[11] Smith-White J, Gunn L, Summerell B. Analysis of diversity withinpopulations using molecular and vegetative compatibility grouping [J]. Australas Plant Pathol., 2001,30:153-157

[12] Armstrong GM, Armstrong JK. Formae speciales and races ofcausing wilt diseases. In: Fusarium: Diseases, Biology and Taxonomy (Cook, R., ed.) [M]. University Park, PA: Penn State University Press, 1981

[13] Gordon T, Martyn R. The evolutionary biology of[J]. Annu. Rev. Phytopathol., 1997,35:111-128

[14] Dean R, Van Kan JA, Pretorius ZA. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [J]. Mol Plant Pathol, 2012,13:414-430

[15] Wingfield M, Hammerbacher A, Ganley R. Pitch canker caused by-A growing threat to pine plantations and forests worldwide [J]. Australas. Plant Pathol., 2008,37:319-334

[16] Storer A, Gordon T, Clark S. Association of the pitch canker fungus,f. sp., with Monterey pine seeds and seedlings in California [J]. Plant Pathol., 1998,47:649-656

[17] Dick MDK. Species ofonin New Zealand [J]. N. Z. Plant Prot., 2002,55:58-62

[18] Viljoen A, Marasas W, Wingfield M,. Characterization off. sp.causing root disease ofseedlings in South Africa [J]. Microbiol. Res., 1997,101:437-445

[19] Ocamb C, Juzwik J, Martin F.spp. andseedlings: root disease pathogens and taxa associated with seed [J]. New forests, 2002,24:67-79

[20] Lazreg F, Belabid L, Sanchez Jet al. First report ofcausing damping-off disease on aleppo pine in Algeria [J]. Plant Dis., 2014,98:1268

[21] Lazreg F, Belabid L, Sanchez JFirst report ofcausing damping-off disease on Aleppo pine in Algeria [J]. Plant Dis., 2013,97:557

[22] Lazreg F, Belabid L, Sanchez JFirst report ofcausing damping-off disease on Aleppo pine in Algeria [J]. Plant Dis., 2013,97:1506

[23] Lazreg F, Belabid L, Sanchez J. First report ofas a causal agent of Aleppo pine damping-off in Algeria [J]. Plant Dis., 2013,97:997

[24] Machón P, Pajares JA, Diez JJ,. Influence of the ectomycorrhizal funguson pre-emergence, post-emergence and late damping-off byandon Stone pine seedlings [J]. Symbiosis, 2009,49:101-109

[25] Machon P, Santamaria O, Pajares JA,. Influence of the ectomycorrhizal funguson pre-emergence, post-emergence and late damping-off byandon Scots pine seedlings [J]. Symbiosis, 2006,42:153-160

[26] Fajardo MA, León JD, Correa GA,. The causal agent of damping-off in(Schiede) and(Schwerdtf.) [J]. Floresta e Ambiente, 2019,26: e20190050

[27] Dar GH, Beig M, Ahanger F,. Management of root rot caused byandin blue pine () through use of fungal antagonists [J]. Asian J. Plant Pathol., 2011,5:62-67

[28] Luo X, Yu C. First report of damping-off disease caused byinin China [J]. J. Plant Dis. Prot., 2020,127:401-409

Identification, Pathogenicity, and Characteristic of Pine Wilt in Shandong Province, China

LV Juan1,2, QI Yu-kun2, JI Yan-ping2, ZHANG Zhong-xia1, ZHAO Hai-yan3, LIU Yin2, HAN Feng-ying4, WANG Qing-hai2*

1.250103,2.250014,3.266109,4.251100,

To verify the agents and its characterization ofwilt, the pure cultures were obtained by use of tissue isolation and monosporic isolation, and identified according to morphological characteristics, multilocus phylogenetic (ITS, and) analyses, and pathogenicity tests. The effects of culture medium, temperature, pH, and light condition on mycelial growth rate were determined. The results showed thatcould causewilt in Shandong province, China.The optimum culture conditions ofS81 were PSA and PDA culture medium, 25°C to 30°C, and pH value 5.0-10.0 for mycelial growth.S81 was insensitive to light conditions, and the mycelial growth rates were not significantly different (< 0.01) at all tested levels.

Pine wilt; pathogen identification; pathogenicity

S436.65

A

1000-2324(2022)01-0077-08

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.013

2021-12-14

20212-01-24

山東省林業科技創新項目(2019LY003-4);中央林業改革發展資金防災減災項目(魯財資環指[2021]27號)

呂娟(1980-),女,本科,高級工程師,從事園林與林業病蟲害及防治技術研究. E-mail:lvjuan1029@163.com

Author for correspondence.E-mail:wqhhai@126.com