納米淡水珍珠粉對成骨細胞成骨活性的影響

廖 軍 徐 普

珍珠由貝體外套膜中的珍珠囊分泌的珍珠質組成，其內部結構與人體骨類似，由95%～99%的結晶磷酸鹽和1%～5%的有機基質組成，其中結晶磷酸鹽的主要成分為文石型碳酸鈣[1]。珍珠分海水珍珠和淡水珍珠，海水珍珠由文石及少量方解石、球文石組成，淡水珍珠則完全由文石組成。珍珠中高含量的鈣離子可以促進鈣鹽沉積，抑制破骨細胞的骨吸收活性，促進骨再生，且其含有的水溶性蛋白具有骨誘導作用，能促進成骨細胞的分化[2,3]。同時，珍珠的納米化可使鈣離子及水溶性蛋白更易于釋放，并減少珍珠的生物降解時間。本實驗研究了納米淡水珍珠粉(nanonized freshwater pearl powder，NFPP)相較于目前研究較成熟的納米羥基磷灰石(nanonized hydroxyapatite，NAHA)對成骨細胞成骨活性的影響，為其在骨組織工程中的應用提供實驗依據。

材料與方法

1.材料與試劑：微米級淡水珍珠粉(海南京潤珍珠有限公司)，納米羥基磷灰石(上海晶純生化科技股份有限公司)，小鼠成骨細胞(江陰齊氏生物科技有限公司)，DMEM/F12(美國Gibco公司)，胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美國Sigma公司)，細胞計數試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ALP 酶聯免疫吸附試劑盒(美國Rapidbio公司)，茜素紅(北京索萊寶科技有限公司)。

2.儀器與設備：立式雙軸納米陶瓷砂磨分散機(深圳市科力納米工程設備有限公司)，冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)，Co-60γ輻照裝置(北京原子高科金輝輻射技術應用有限公司)，CO2細胞培養箱(日本Sanyo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，酶聯免疫檢測儀(美國Thermo Fisher公司)。

3.無菌NFPP的制備：將微米級淡水珍珠粉以立式雙軸納米陶瓷砂磨分散機研磨成納米級，然后經冷凍干燥及60Co輻照滅菌制備成無菌NFPP。

4.實驗分組：實驗組為NFPP組，陽性對照組為NAHA組，陰性對照組為空白組。

5.成骨細胞培養：成骨細胞以D/F12培養基在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液，待細胞融合達80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

6.細胞貼壁實驗：實驗分實驗組及陽性對照組，按細胞密度5×104個/毫升接種至培養皿中，按實驗分組將NFPP和NAHA各1ml緩慢加入培養皿中，使培養基剛好沒過材料，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。待培養7h后，PBS沖洗3次，將培養皿中的實驗材料沖洗干凈，胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓、分離后加入D/F12培養基終止消化，混勻，吸取10μl細胞懸液及10μl臺盼藍混勻后做細胞計數。按下列公式計算細胞貼壁率：貼壁率(%)=[(接種細胞數-細胞計數)/接種細胞數]×100%。

7.CCK-8細胞增殖活性檢測：按細胞密度1×104個/毫升接種于24孔培養板中，每孔1ml，按實驗分組將NFPP和NAHA各200μl加入到細胞懸液中，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，隔天換液。分別在培養的第3、5、7天取24孔培養板檢測，向各實驗組中加入100μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2恒溫培養箱中孵育3.5h后每孔吸取100μl于96孔板中，酶標儀450nm處測定吸光度(A)值。

8.堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定：細胞接種同前。分別在培養后的第3、5、7天取24孔培養板檢測，向各實驗組中加入400μl 1%Triton-100液，常溫下裂解30min后將細胞懸液轉移至1.5ml EP管中。將EP管置于冰上，超聲波細胞破碎儀破碎5s，然后將EP管轉移至低溫高速離心機中，12000r/min、4℃離心30min。按小鼠ALP酶聯免疫吸附試劑盒使用說明于波長450nm處測各孔的A值。

9.茜素紅染色：按細胞密度1×104個/毫升接種至培養皿中，按實驗分組將分別盛有NFPP和NAHA的細胞篩置入培養皿中，使培養基剛好沒過材料，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，隔天換液。培養至第7天時行茜素紅染色，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，蒸餾水沖洗3遍，2%茜素紅溶液染色15min，蒸餾水沖洗3遍后倒置顯微鏡下拍照，以Image-Pro Plus 6.0行礦化面積測定。

結 果

1.細胞貼壁實驗:實驗組較陽性對照組中的細胞貼壁率高(36.04%±3.21% vs 27.38%±6.39%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.CCK-8細胞增殖活性檢測：如表1、表2所示，各組中成骨細胞的數量隨時間的推移而增加，且在各時間點細胞數量實驗組高于陽性對照組高于陰性對照組。培養第3天時，實驗組與陰性對照組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。培養第5天時，實驗組與兩個對照組間比較，差異均有統計學意義

表1 CCK-8實驗各組各時間點所測A值的比較

表2 CCK-8各時間段A值兩兩比較P值

3.ALP活性測定:各組中ALP活性隨時間的推移而增加，且在各時間點ALP活性實驗組高于陽性對照組高于陰性對照組。培養第3天、5天時，實驗組與兩個對照組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，兩個對照組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。培養第7天時，各實驗組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表3、表4。

表3 ALP活性檢測各組各時間點所測A的比較

表4 ALP活性檢測各時間段A值兩兩比較P值

4.茜素紅染色:細胞匯合呈集落生長，細胞間紅褐色結節面積實驗組(45.79%)大于陽性對照組(40.74%)大于陰性對照組(15.54%)，詳見圖1。

圖1 鈣結節茜素紅染色(×400)

討 論

自1992年法國科學家Lopezt等[4]發現珍珠質層具有誘導成骨作用以來，陸續有研究表明珍珠層具有良好的生物相容性，骨誘導及骨傳導作用。而珍珠層中的蛋白在促進成骨細胞分化及組織礦化中起著重要作用。珍珠與貝殼珍珠層均由珍珠囊分泌的珍珠質組成，兩者成分和結構非常相似，均由高于95%的礦物質和低于5%的有機基質組成，但珍珠中的有機質含量和蛋白質含量均較貝殼珍珠層中的高，故研究者開始研究珍珠的成骨作用。

研究證實，珍珠粉能促進成骨細胞的增殖、分化及鈣結節的形成，并抑制成骨細胞的凋亡[5]。與微米級比較，納米級具有更好的生物降解性及促骨組織再生作用[6,7]。但與目前研究較成熟的NAHA比較，NFPP促成骨作用如何尚缺少報道。本實驗通過對比NFPP與NAHA對成骨細胞成骨活性的影響，研究其在骨組織工程中的應用價值。

在骨組織缺損的修復過程中，成骨相關細胞在骨缺損區的定植黏附至關重要[8]。本研究中實驗組中細胞貼壁率高于陽性對照組，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。因考慮NFPP及NAHA為納米級粉末狀，其材料本身無定型且無特定孔隙，而研究表明珍珠粉中含有的有機蛋白具有骨誘導作用，可誘導成骨相關細胞的聚集并促進成骨細胞的分化，實驗所得材料對細胞貼壁的影響考慮主要為有機蛋白的作用；但材料本身的三維結構及孔隙率也影響著骨缺損區骨組織再生[9]。當骨移植材料植入骨缺損區后，有兩種成骨方式，即接觸成骨與距離成骨。接觸成骨較距離成骨成骨速度快，在早期骨再生中起著重要作用。在接觸成骨中，成骨細胞黏附是植入材料與成骨細胞接觸的第一步，直接影響成骨細胞在骨移植材料表面的增殖及分化。研究所得兩組間細胞貼壁率差異無統計學意義的可能因素之一為材料不具有特定孔隙率的三維支架結構，后續研究中需將NFPP制備成具有穩定三維結構的骨移植材料進一步測定其對細胞定制黏附的影響。

當成骨相關細胞在骨缺損區遷移定植后，進一步增殖分化并分泌細胞外基質參與組織礦化。本研究結果表明，NFPP和NAHA均能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化結節形成，且NFPP較NAHA能更顯著地促進成骨細胞的增殖、分化。成骨細胞是骨生成的主要細胞，能分泌多種成骨相關蛋白，包括骨橋蛋白、膠原蛋白、轉化生長因子及ALP等，促進細胞外基質的合成及礦化[10,11]。如骨橋蛋白能促進磷酸鈣的沉積及調控羥基磷灰石晶體的大小和形態[12,13]。膠原蛋白能促進細胞黏附，為營養物質、氧和具有機械傳導作用的分子提供良好的組織通透性[14,15]。轉化生長因子能促進未分化間充質干細胞向成骨細胞分化[16]。其中ALP是成骨細胞早期分化的特異性標志物，其分泌量隨成骨細胞的分化而增加[17]。

ALP能水解磷酸酯鍵，釋放無機磷，增加局部組織中磷酸根的濃度從而促進磷酸鈣的沉積并延續鈣化過程，是細胞外基質礦化啟動所必須的，而礦化結節的形成標志著成骨細胞的分化成熟，是成骨細胞功能表達的主要形態學表現[18,19]。骨缺損的修復是成骨相關細胞如間充質干細胞、成骨細胞等定植、增殖、分化及礦化的一系列有機連續的整體過程。局部組織中成骨細胞增殖數及分化程度越好，其分泌的成骨相關蛋白及ALP表達越高，則越有利于骨組織再生。本研究中NFPP可促進小鼠成骨細胞的增殖、分化及礦化，與骨缺損修復過程基本一致，表明NFPP可能在生物體內調控骨組織再生并起促進作用。

綜上所述，NFPP較NAHA能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化結節的形成。但目前實驗尚未在蛋白及基因層面檢測對比研究，且人體是一個復雜的有機整體，骨移植材料對骨再生的影響還可能通過機體的局部環境和宏觀網絡來調控。同時，對于骨移植材料，如能具有一定孔隙率及孔隙大小的三維空間結構則更有利于新生骨組織的爬行替及新生血管的長入，為骨組織的血管化提供足夠的空間，并為骨組織再生所需空間起到維持作用。故后續研究中可進一步研究NFPP對成骨細胞相關蛋白及成骨基因表達的影響，并可將NFPP復合成具有適當孔隙率的三維空間結構的骨移植材料，在動物體內進一步驗證其成骨作用。