加味滌痰湯對卒中后認知障礙患者外周血miRNAs 組合表達的影響研究

羅 瑋，劉 玲，戴麗星，曾 華

（1.江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院全科醫(yī)學科，武漢 430030；2.湖北省中醫(yī)院 腦病科，武漢 430000；3.武漢市中醫(yī)醫(yī)院 肛腸科，武漢 430000）

卒中后認知功能障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中后常見的認知障礙類型，包括從卒中后認知障礙非癡呆到卒中后癡呆的不同程度的認知障礙[1]，給卒中后患者的日常生活、社會能力等方面造成嚴重影響[2]。PSCI 的早期評估、診斷和治療尤為重要，其中外周血血清中的一些生物標志物與PSCI 的診斷具有相關(guān)性[3]。加味滌痰湯是本研究團隊前期重點研究的方藥，并已證實該方具有明顯改善PSCI 患者認知功能和日常生活能力的作用。本研究通過觀察加味滌痰湯對PSCI 患者血清miRNAs 表達的影響，探討加味滌痰湯的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年5 月－2021 年1 月在江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院住院患者及門診患者作為觀察病例，共30例。男13例，女17例；年齡50～75 歲，平均（65.64±5.63）歲；受教育年限6～16年，平均（10.48±2.18）年。另收集同期認知功能正常的健康體檢者30例為對照組，男14例，女16例，年齡50～75 歲，平均（63.95±4.78）歲，受教育年限6～16 年，平均（10.88±2.79）年。2 組性別、年齡、受教育年限等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[4]（2010 年版）和《血管性認知障礙診治指南》（2011 年版）中VCl 的診斷建議[5]擬定。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準 參照血管性癡呆（VD）的中醫(yī)辨證量表（SDSVD）[6]擬定，證型為痰濁阻竅型。主癥：智力減退、思維遲鈍、表情淡漠或神情呆滯、口多痰涎、頭昏頭重、體胖臃腫、舌胖大或有齒痕、脈滑或濡等。

1.2.3 納入標準 1）年齡≥40 歲；2）符合西醫(yī)診斷標準，病程2 周～6 個月；3）符合中醫(yī)診斷標準；4）符合腦卒中后輕度認知障礙診斷標準，MoCA 量表評分＜26 分，CDR 評分＜0.5 分；5）意識清楚，具備視覺、聽覺分辨力，能接受神經(jīng)心理學測試；6）知情同意本研究。

1.2.4 排除標準 1）其他疾病所致的認知障礙；2）長期服用治療認知功能障礙的藥物或其他藥物而影響療效評價者；3）已知的對于中藥組方成分過敏者；4）合并嚴重胃、十二指腸疾病影響藥物吸收者。

1.3 治療方法 PSCI 治療組均接受基礎(chǔ)治療，輔以心理疏導，幫助調(diào)節(jié)不良情緒。治療組均給予加味滌痰湯治療，方藥組成：茯苓15 g，制半夏、制南星、橘紅、炒枳實、竹茹、人參、丹參、川芎各10 g，石菖蒲、生姜、炙甘草各6 g，水煎服，每日200 mL，觀察時間為8 周，方藥隨證加減，在治療期間避免服用其他益智類藥物。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 確立目標miRNAs 組合 1）總RNA 提取及檢測；2）高通量測序；3）數(shù)據(jù)預處理：從測序得到的Raw data 中過濾出目標片段，統(tǒng)計miRNA 的種類及數(shù)量，并對小RNA 做長度分布統(tǒng)計；4）數(shù)據(jù)分析：基因組對比，對已知miRNA 的鑒定和表達量分析，使用DEGseq 軟件進行miRNA 表達差異分析。5）對已知miRNA 以及新miRNA 預測得到的靶基因進行KEGG和GO 功能注釋，進一步篩選出功能性差異miRNAs為目標miRNAs 組合。

1.4.2 血清miRNAs 檢測 取清晨空腹外周靜脈血各5 mL，室內(nèi)靜置后，血標本自然凝固，再以13.5 cm的離心半徑，3 500 r/min 速度離心20 min，得到分離后的血清樣本。采用熒光定量PCR 法檢測血清目標miRNAs 水平，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。檢測步驟：1）總RNA 的提取，使用血清miRNA 提取分離試劑盒說明書提取血清中總miRNAs，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）總RNA 中DNase1 的消除，在37℃，30 min；Hold，加1 μL 的EDTA；65℃，10 min，得到總RNA 中DNA 的消除。反轉(zhuǎn)錄，RNA中基因組DNA 消除并除去DNase1 后，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?）Real-time PCR 擴增，將制備好的cDNA 進行PCR 擴增，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：qbase plus。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件包，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對樣本t檢驗；計量資料采用t檢驗；以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 測序樣本總RNA 質(zhì)量檢測 對3例腦卒中后無認知障礙者、3例PSCI 患者、3例健康人血清共9 個樣本進行miRNA 高通量測序，分別提取血清總RNA，3 組樣本分別為PSCI-K 組、PSCI-P 組和Control 組。各樣本RNA 質(zhì)量及濃度檢測見表1，9個樣本的RNA 質(zhì)量及濃度均符合miRNA 高通量測序建庫標準。

表1 樣本總RNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 數(shù)據(jù)預處理 將測序得到的raw data 進行數(shù)據(jù)預處理得到clean data。9 個樣本中的Clean data 數(shù)均占raw data 數(shù)的80%以上，見表2。

表2 所有樣本Small RNA clean 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 差異miRNAs 篩選 結(jié)果顯示，與對照組相比，在腦卒中（無認知障礙）患者中共有40 個差異miRNAs（19 個上調(diào)，21 個下調(diào)），在PSCI 患者中共有43 個差異miRNAs（21 個上調(diào)，22 個下調(diào)）。使用維恩圖統(tǒng)計2 個對比組共有的差異miRNAs，發(fā)現(xiàn)有20 個共同的差異miRNAs，結(jié)合差異miRNAs 功能分析結(jié)果，本研究挑選miR-31，miR-93，miR-143，miR-146a，miR-107，miR-222，let-7g，miR-126，miR-29a，miRNA-34a 作為目標miRNAs 組合進行研究。

2.4 PSCI 組治療前與對照組血清miRNAs 比較 PSCI組治療前，較對照組血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126表達明顯升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a表達明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 PSCI 組治療前與對照組血清miRNAs 比較（n =30）

2.5 PSCI 組治療前后血清miRNAs 比較 與治療前比較，PSCI 組治療后血清miR-29a、miRNA-34a 表達明顯升高（P＜0.05），miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 表達顯著降低（P＜0.05），miR-107 表達明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 PSCI 組治療前后血清miRNAs 比較（n =30）

3 討論

卒中后認知障礙與卒中有著共同的發(fā)病機制，本研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，PSCI 中醫(yī)證型與篩選出的miRNAs 有著對應關(guān)系，因此miRNAs 組合的表達情況可能為早期診斷PSCI 及加味滌痰湯的干預作用提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，PSCI 組治療前血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 表達明顯升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a 表達明顯降低（P＜0.05），這與多篇文獻報道結(jié)果一致。其中，雖然可見血清miR-222 表達水平升高，let-7 g表達降低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與部分文獻結(jié)果不一致[7-8]。

miR-31 被稱為BCL6 的靶標，可以通過抑制PKD1 表達來減少細胞損傷，miR-31 下調(diào)使IS 小鼠的腦梗死面積和氧化應激水平顯著降低，可能與改善PSCI 有關(guān)[9]。miR-93 在急性IS 中具有診斷和預測潛力，并且可能通過靶向小膠質(zhì)細胞的增殖而參與炎癥反應[10]。miR-93 拮抗劑可減輕過氧化氫誘導的損傷，抑制皮質(zhì)神經(jīng)元，miR-93 的下調(diào)發(fā)揮miR-93 拮抗劑誘導的抗氧化應激的神經(jīng)保護作用，減輕卒中后的缺血性損傷及認知損害[11]。miR-143 參與神經(jīng)誘導保護，中風誘導miR-143 上調(diào)，阻止了RLIP 誘導的神經(jīng)保護和HIF1-α 過表達[12]。miR-146a 在本實驗結(jié)果中呈現(xiàn)顯著上調(diào)，與相關(guān)研究一致，miR-146a 在腦卒中急性期呈現(xiàn)下調(diào)，而在亞急性期呈現(xiàn)上調(diào)[13]。miR-146a（rs2910164）可以用作中風預后的診斷標志物，而該位點被認為與認知障礙有關(guān)[14]。miR-146a 在誘導巨噬細胞的Toll 樣受體耐受中起主要作用，參與改變炎癥性認知障礙風險基因表達的作用[15]。miR-107 的水平在IS 患者中顯著增加，與中風的程度呈正相關(guān)[16]。miR-126 的表達水平與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)，對于預測患者的預后非常有價值[17]。體內(nèi)缺血后miR-126 表達降低，能顯著降低氧葡萄糖剝奪和復氧（OGD/R）觸發(fā)的凋亡，競爭性內(nèi)源RNA 直接與miR-126 結(jié)合，調(diào)節(jié)缺血性神經(jīng)元死亡，減輕神經(jīng)功能障礙[18]。中風后給予miR-126 外泌體可改善功能恢復，增強神經(jīng)發(fā)生，抑制神經(jīng)炎癥[19]。miR-126 和miR-143 可能同時參與動脈粥樣硬化的進程，且兩者與動脈粥樣硬化的嚴重程度相關(guān)，被認為可能是特異性生物標志物[20]。miR-29a 在抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖同時能誘導細胞凋亡[21]，miR-29a 過表達可促進大鼠腦出血后軸突的再生長出，改善神經(jīng)行為和認知障礙，減輕神經(jīng)元損傷和線粒體功能障礙，并促進神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長[22]。miR-34a 呈現(xiàn)顯著下調(diào)，可作為生物標志物進行預測缺血性腦卒中的風險[23]。miRNA-34a 通過調(diào)節(jié)Notch 信號傳導參與細胞凋亡，其抑制劑可降低動作電位的頻率，激活Notch信號傳導并防止神經(jīng)元凋亡[24]。實驗發(fā)現(xiàn)，敲除APP/PS1 小鼠中的miR-34a 可顯著降低行為功能障礙[25]。

PSCI 屬中醫(yī)學的“健忘”“呆病”“郁證”范疇。現(xiàn)代中醫(yī)學者認為，PSCI 的病機特點為正氣內(nèi)虛，痰、瘀等實邪阻滯，治療應為溫陽補氣、開竅醒神、化痰通絡(luò)、活血化瘀為主[26]。加味滌痰湯出自南宋嚴用和《濟生方》的經(jīng)方滌痰湯，化裁后具有益氣祛痰、化濁開竅的療效。本方橘紅、半夏、天南星、茯苓健脾安神、化痰理氣，枳實、竹茹化痰消痞、清熱化瘀，人參大補元氣、益智安神，石菖蒲寧心開竅、化濕和胃，川芎、丹參行氣止痛，生姜、甘草調(diào)和全方，全方共奏健脾化痰、益氣活血、醒腦開竅之功。加味滌痰湯可通過提高皮質(zhì)乙酰膽堿水平，調(diào)控模型大鼠皮質(zhì)谷氨酸水平，增加大鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，改善血管性輕度認知功能障礙大鼠的學習記憶能力，以及降低模型大鼠腦皮質(zhì)IL-6、TNF-α、NO 的含量及NOS 活性，起到神經(jīng)保護作用[27-28]。

綜上所述，miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 及miR-29a、miRNA-34a 表達水平可能有助于PSCI 患者的早期診斷，但仍需進一步擴大樣本量來驗證；加味滌痰湯能升高PSCI 患者外周血血清miR-29a、miRNA-34a 的水平，顯著降低miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 的水平，使miR-107的水平降低，推測加味滌痰湯可能通過參與卒中后的炎癥反應、改善動脈粥樣硬化、參與神經(jīng)保護及認知功能的改善而發(fā)揮治療PSCI 的作用，其詳細的調(diào)節(jié)機制還需要更深入的研究。