氧化苦參堿靶向miR-520e 調控AEG-1 介導的結腸癌細胞的轉移、侵襲活性

易 默，吳友偉，張 健，何 瑜，劉 倩，史麗萍，呂颯美

（陜西省人民醫院消化內二科，西安 710068）

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢。研究[1]發現氧化苦參堿（OMT）通過上調miR-211-5p 可減輕脂多糖誘導的炎癥反應。OMT 可通過調節上皮間質轉化過程抑制結腸癌細胞增殖、遷移[2]。微小RNA（microRNA）具有促癌或抑癌作用，miR-520e 在膠質瘤、肝癌以及非小細胞肺癌中具有抑癌作用[3-5]。星形膠質細胞瘤上調基因1（AEG-1）是調控癌細胞增殖、遷移和侵襲的關鍵因子。研究[6]發現，AEG-1 在結腸癌中高表達，而miR-520e 可靶向作用于AEG-1，抑制其表達活性。本研究探討OMT 是否能調節miR-520e 從而降低AEG-1 表達，抑制結腸癌細胞惡性生物學行為。報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人結腸癌細胞SW480 購自中科院上海細胞庫。

1.2 試劑與儀器 OMT 購自美國Sigma 公司；si-NC、miR-520e inhibitor 和miR-520e mimic 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；5-氟尿嘧啶購自北京索萊寶科技有限公司；MTT 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；兔抗人AEG-1、信號轉導子與激活子3（signal trans ducers and activators of transcription 3，STAT3）和 白 介 素6（interleukin-6，IL-6）抗體購自美國Abcam 公司；全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 細胞培養 結腸癌細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中，每2 天更換1 次培養基，待細胞密度80%以上時進行細胞傳代，傳至第4 代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.4 MTT 法檢測不同濃度OMT 對結腸癌細胞增殖的影響 將對數生長期的細胞制成單細胞懸液，接種于96 孔板，1×105個細胞/孔，置于培養箱中培養，待細胞貼壁生長后，將細胞隨機分為OMT 不同濃度組以及陽性對照組，用含不同濃度的OMT（0、10、30、50、70、90 μmol/L）培養基進行培養，陽性對照組用50 μmol/L 的5-氟尿嘧啶培養基培養，每組設置5 個復孔，培養箱中培養24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，置于培養箱中繼續培養4 h，棄掉培養液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩混勻，置于酶標儀上測定490 nm 波長處的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組A 值/對照組A 值）×100%。

1.5 不同藥物處理對結腸癌細胞存活率的影響 將對數生長期的細胞制成單細胞懸液，接種于96 孔板，1×105個細胞/孔，置于培養箱中培養，待細胞貼壁生長后，將細胞隨機分為對照組（Control 組）、OMT組、陰性對照組（NC 組）、miR-520e 抑制物組（miR-520e inhibitor 組）和OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設置5 個復孔。70 μmol/L OMT 對細胞的抑制率接近于陽性對照組，故后續實驗采用70 μmol/L OMT。根據LipofectaminTM2000 說明書，NC 組細胞轉染陰性對照片段24 h，miR-520e inhibitor 組細胞轉染miR-520e抑制物24 h，OMT+miR-520 e inhibitor 組細胞轉染miR-520e 抑制物24 h 后，更換為含70 μmol/L OMT 的培養基培養24 h，按照1.4 的實驗方法計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1.6 qRT-PCR 檢測細胞中miR-520e 的表達水平 對數生長期的細胞隨機分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設置5個復孔，按照1.5的處理方法進行處理，24 h后，收集各組細胞，Trizol 試劑提取細胞中總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉成cDNA，以U6為內參基因，進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，0.5 μL 上游引物和0.5 μL 下游引物，cDNA 1 μL，無核酶水8 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行40 個循環，采用2-△△CT計算miR-520e表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 對數生長期的細胞隨機分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設置5個復孔，按照1.5 的處理方法進行處理，用100 μL 無菌槍頭均勻劃線，PBS 洗去細胞碎片，分別在劃線0 h和24 h，顯微鏡下觀察并拍照，Image Pro plus 6.0 軟件分析劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1.8 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 對數生長期的細胞隨機分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520e inhibitor 組、OMT+miR-520e inhibitor 組，每組設置5個復孔，按照1.5 的處理方法進行處理。將細胞制成細胞懸液，經Matrigel 膠包被的Transwell 小室的上室中加入200 μL 單細胞懸液，下室中加入DMEM 培養基500 μL，24 h 后進行多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下拍照，計算侵襲細胞數。

1.9 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-520e 與AEG-1 的靶向關系 TargetScan 軟件預測miR-520e 與AEG-1 的3’UTR 具有結合位點，構建野生型AEG-1 熒光素酶表達載體（WT-AEG-1）和突變型AEG-1 熒光素酶表達載體（Mut-AEG-1），采用脂質體轉染法分別將miRNC 和miR-520e mimic 共轉染至結腸癌細胞中，以海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值代表miR-520e 與AEG-1 的結合強度。

1.10 蛋白印跡法檢測AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達量 對數生長期的細胞隨機分為Control 組、OMT 組、NC 組、miR-520 e inhibitor 組以及OMT+miR-520 e inhibitor 組，每組設置5 個復孔，按照1.5 的處理方法進行處理。收集細胞，加入裂解液裂解30 min，離心，取上清，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，煮沸。上樣，120 V 電泳1.5 h，0.3 A 濕轉2 h，TBST 洗膜5 次，室溫封閉1 h，GAPDH、AEG-1、IL-6d、p-STAT3 和STAT3 一抗（1:1000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗（1:5000）室溫孵育1 h，ECL 顯色，Image J 分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值為目的蛋白相對表達量。

1.11 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料均以均數±標準差（）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，2 組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較（，n =5）%

表2 各組細胞增殖抑制率比較（，n =5）%

注：與10 μmol/L OMT 組比較，# P ＜0.05；與30 μmol/L OMT組比較，△P ＜0.05；與50 μmol/L OMT 組比較，▲P ＜0.05；與70 μmol/L OMT 組比較，□P ＜0.05；與90 μmol/L OMT 組比較，■P ＜0.05

2.2 各組細胞miR-520e 表達水平比較 見表3。

表3 各組細胞miR-520e 表達水平比較（，n =5）

表3 各組細胞miR-520e 表達水平比較（，n =5）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.3 各組細胞存活率比較 見表4。

表4 各組細胞存活率比較（，n =5）%

表4 各組細胞存活率比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□ P ＜0.05

2.4 各組細胞劃痕愈合率比較 見表5，圖1。

圖1 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

表5 各組細胞劃痕愈合率比較（，n =5）%

表5 各組細胞劃痕愈合率比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.5 各組侵襲細胞數比較 見表6，圖2。

圖2 Transwell 實驗檢測細胞侵襲情況（×200）

表6 各組侵襲細胞數比較（，n =5）%

表6 各組侵襲細胞數比較（，n =5）%

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

2.6 熒光素酶報告基因檢測結果 轉染miR-520e mimic后，野生型AEG-1相對熒光素酶活性顯著降低，而突變型AEG-1相對熒光素酶活性無影響，見表7，圖3。

圖3 AEG-1 與miR-520e 結合位點與突變位點

表7 相對熒光素酶活性比較（，n =5）

表7 相對熒光素酶活性比較（，n =5）

2.7 各組細胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達量比較 見表8，圖4。

圖4 細胞中各蛋白表達情況

表8 各組細胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達量比較（，n =5）

表8 各組細胞中AEG-1、IL-6 和STAT3 蛋白相對表達量比較（，n =5）

注：與Control 組比較，# P ＜0.05；與OMT 組比較，△P ＜0.05；與NC 組比較，▲P ＜0.05；與miR-520e inhibitor 組比較，□P ＜0.05

3 討論

結腸癌具有高侵襲性和高轉移能力，其惡性程度僅次于肺癌和乳腺癌，手術仍是治療結腸癌的常用手段，但術后復發率高[7]。研究[8]表明，OMT 通過阻滯細胞周期，調節癌細胞遷移相關蛋白，可抑制胰島素引起的結腸癌細胞遷移和侵襲。OMT 通過抑制程序性細胞死亡1 蛋白表達活性可逆轉非小細胞肺癌細胞A549 對化療藥物順鉑的耐藥性[9]。本研究以結腸癌細胞SW480 為研究對象，探討OMT 對癌細胞惡性行為學的影響及其調控機制。

本研究結果顯示，隨著OMT 濃度的增加，細胞增殖活性逐漸降低，且具有劑量依賴性，表明OMT可抑制結腸癌細胞增殖。miR-520e 被認為是一種抑癌基因，在多種腫瘤中具有抑癌作用，在肺癌細胞A549中miR-520e 的表達明顯低于正常肺上皮細胞，miR-520e 過表達可降低癌細胞的遷移率、減少侵襲細胞數[10]。言成一等[11]研究表明，miR-520e 在非小細胞肺癌癌細胞中低表達，轉染miR-520e mimic 后可抑制癌細胞的增殖活性，降低癌細胞遷移和侵襲能力。本研究結果顯示，SW480 轉染miR-520e inhibitor 后，miR-520e 表達水平降低，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+mi R-520e inhibitor 組miR-520e 表達水平升高，可見OMT 可上調miR-520e 的表達。本研究通過MTT法實驗結果顯示，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組細胞存活率升高，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組細胞存活率降低，結果表明OMT 可上調miR-520e 表達，抑制癌細胞增殖活性。劃痕實驗結果表明，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組劃痕愈合率降低，與miR-520e inhibitor組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組劃痕愈合率升高，表明OMT可上調miR-520e表達，降低癌細胞遷移能力。Transwell 實驗結果顯示，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組侵襲細胞數增多，與miR-520e inhibitor組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組侵襲細胞數減少，表明OMT可上調miR-520e表達，降低癌細胞侵襲能力。

AEG-1 是一種公認的促癌基因，在癌細胞的惡性生物行為學中發揮調控作用。研究[12]發現AEG-1 表達下調，可增強膠質瘤細胞對輻射的敏感性。研究[13]發現AEG-1 可促進舌鱗狀細胞癌血管再生，因此AEG-1 可能成為治療舌鱗癌的潛在靶點。研究[14]報道AEG-1 通過上調eIF4E 的表達促進胃癌的生長。腫瘤微環境是腫瘤細胞發生侵襲和遷移的重要原因之一，IL-6 是微環境中其主要作用的炎性細胞因子，而STAT3 是重要的轉錄活性因子，具有信號轉導和轉錄激活的作用。當IL-6 與其受體結合后，可誘導下游特定的酪氨酸殘基磷酸化，激活STAT3 發生磷酸化形成二聚體，轉移至細胞核與靶基因的特定位點結合，調節基因轉錄活性，參與調控細胞增殖、分化[15]。研究[16]發現，肝癌組織中p-STAT3 表達升高，IL-6 可誘導肝癌細胞中STAT3 發生磷酸化，促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。研究[17]發現茶多糖通過抑制IL-6/STAT3 途徑抑制結腸炎相關的大腸癌。研究[18]表明，在結腸癌細胞中下調AEG-1 表達，可通過抑制IL-6/STAT3 信號通路誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。本研究結果顯示，OMT 組AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達量低于Control 組，與OMT 組比較，OMT+miR-520e inhibitor組AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相對表達量升高，與miR-520e inhibitor 組比較，OMT+miR-520e inhibitor 組AEG-1、IL-6 和p-STAT3 蛋白相對表達量降低，結果表明OMT 可上調miR-520e抑制AEG-1/IL-6/STAT3 信號通路。

綜上所述，OMT 可抑制結腸癌細胞增殖，降低癌細胞遷移和清洗能力，可能是通過上調miR-520e 抑制AEG-1 蛋白表達發揮作用。