左乙拉西坦注射液血管刺激性研究

李權寧，卜艷紅，李遼遼，李東波，馮柯臻，趙正杭（1.西安交通大學醫學部基礎醫學院，西安 710061；.西安遠大德天藥業股份有限公司，西安 710119；.西安交通大學公共衛生學院，西安 710061；.西安交通大學藥學院，西安 710061）

癲癇是一種中樞神經系統疾病，其特征是腦神經元異常放電導致反復發作或異常的行為和感覺，嚴重時喪失意識，可造成神經、認知、心理和社會等后果。據文獻報道，全世界約有7000 萬癲癇患者，我國癲癇的總體患病率約為0.76%，有900 萬左右的癲癇患者，其中活動性癲癇患者約600 萬，同時每年新增患者約40 萬，給家庭和社會造成了很大的負擔。臨床發現，如果對癲癇初患進行合理治療、用藥，其中70%～80% 可以得到有效控制，在得到控制的患者中，經過2 ～5年治療可以停藥的患者占60%～70%，但仍有約30% 的患者需要經多種藥物聯合治療后依然發展成為難治性癲癇。目前我國治療癲癇的藥物種類仍嚴重匱乏，使多數患者不能得到及時有效的治療。數據顯示，在我國900 萬癲癇患者中，有40.6%的癲癇患者未得到治療，35.4%的治療不正規。

1999年11月30日UCB Pharma S.A.公司研制的左乙拉西坦（levetiracetam）在美國首次獲批上市，因臨床療效確切，應用廣泛，為方便癲癇患者用藥，隨后該公司相繼又開發了緩釋制劑、口服液及注射液。本研究旨在探索西安遠大德天藥業股份有限公司生產的仿制藥——左乙拉西坦注射液對家兔血管的刺激性，為該藥物的上市申請及臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 試藥

左乙拉西坦注射液（規格：500 mg/5 mL，西安遠大德天藥業股份有限公司，批號：DT20210301）；0.9% 氯化鈉注射液（規格：100 mL/0.9 g，江蘇淮安雙鶴藥業有限責任公司，批號：1906144C）；戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：WS20190411）。

1.2 儀器

電子秤（ALH-30，上海英展機電）；自動染色機（ST4040，Leica）；光學顯微鏡（BX41，OLYMPUS）；分體注射泵（SPC，保定申辰）。

1.3 實驗動物

普通級新西蘭兔6 只，雌雄各半，體質量2.0 ～3.0 kg，動物生產許可證號SCXK（蘇）2019-0005（南京市浦口區萊芙養殖場）。動物飼養房間溫度18 ～26℃，相對濕度40%～70%，每小時換氣≥8 次，照明100 ～200 lx，照明時間12 h。動物自由覓食、飲水。

2 方法

2.1 藥物配制

以左乙拉西坦注射液成人患者的臨床最大擬給藥質量濃度13 mg·mL為研究給藥質量濃度。取左乙拉西坦注射液3 瓶，加入100 mL 的0.9%氯化鈉注射液，配制成質量濃度為13 mg·mL的供試品溶液。0.9% 氯化鈉注射液作為對照溶液。

2.2 給藥劑量

根據臨床用法用量，推薦左乙拉西坦最大劑量為3000 mg·d，成人平均體質量按照60 kg計算，人用臨床最大劑量為50.00 mg/（kg·d），兔平均體質量按2.5 kg 計算，兔的臨床等效劑量為137.68 mg·kg，本研究設定兔的給藥劑量為150 mg·kg，約為臨床等效劑量的1.09倍。根據我國《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》要求，該研究設計供試品給藥質量濃度為13 mg·mL、給藥容量為5.8 mL·kg，給藥速率為1 mL·min，給藥頻次為2 次·d、連續3 d。對照組給藥容量、給藥速率、給藥頻次及周期同用藥組。

2.3 研究方案

取6 只新西蘭兔，采用自身對照，微量注射泵耳緣靜脈注射，左耳給左乙拉西坦注射液，右耳給0.9% 氯化鈉注射液，每日2 次，連續3 d。于末次給藥72 h 后處死4 只動物（雌雄各半），剩余2 只動物繼續觀察，14 d 后處死。動物進行常規取材，包括進針部位及耳緣靜脈的整個耳組織，固定于12% 福爾馬林液中。最后進行脫水、包埋、蘇木素伊紅（HE）染色和光鏡檢查。

2.4 結果評價

2.4.1 肉眼觀察 給藥期詳細觀察每次給藥后的60 min 及末次給藥后72 h 內左、右耳注射液部位及周邊組織的刺激反應。在恢復期，每日肉眼觀察注射部位及周圍組織的刺激反應情況。刺激性評價標準如下：“0”表示無明顯刺激性、“1”表示紅斑、“2”表示水腫、“3”表示潰瘍；嚴重程度：“＋”表示輕微，“＋＋”表示明顯，“＋＋＋”表示嚴重。

2.4.2 組織病理學檢查 在剖檢時肉眼觀察耳緣靜脈的刺激性反應。從耳尖到耳根取近、中、遠三段，從耳尖到耳根，距進針部位約1.3 cm 為近段，距進針部位約2.6 cm 為中段，距進針部位約4.0 cm 為遠段。取材范圍可根據進針情況適當放長。最后脫水、包埋、HE 染色和光鏡檢查。所有形態改變根據輕重標記為“±”“＋”“＋＋”“＋＋＋”，分別表示輕微、輕度、中度、重度，無病變標記為“－”，缺失記“無”。

3 結果

3.1 動物一般狀況

在給藥期，每次給藥后的60 min 及末次給藥后72 h 內及恢復期，兔活動、睡眠及其他精神狀態良好，未見有明顯的給藥引起的不良反應；兔毛發光澤順滑，飲食、飲水正常，排便、排尿未見異常。給藥后72 h 和恢復期14 d 兔的體質量變化也未見明顯異常（

P

＝0.157），給藥前后動物體質量變化如表1。

表1 給藥前后動物體質量變化
Tab 1 Changes of animal body mass before and after administration

編號性別體質量/kg給藥前末次給藥后72 h恢復期14 d 1001♂2.♂2.62.6/100293.03.0 1003♂2.93.0/1004♀2.72.7/1005♀2.52.5/1006♀2.72.72.8

3.2 注射部位觀察與評價

在給藥期，用藥組一只兔左耳緣靜脈出現了輕微紅斑癥狀，末次給藥結束觀察72 h 基本恢復正常；對照組一只兔右耳緣靜脈出現了輕微紅斑癥狀，末次給藥結束觀察72 h 基本恢復正常。恢復期，各例兔耳血管未見明顯的刺激性癥狀。結果見表2。

表2 注射部位及周圍組織肉眼觀察刺激性評分表
Tab 2 Visual irritation scores of injection site and surrounding tissues

程度刺激性嚴重程度編號組別給藥期末次給藥后72 h恢復期刺激性嚴重程度刺激性嚴重1001 用藥組0000//對照組0000//1002 用藥組1＋0000對照組000000 1003 用藥組0000//對照組0000//1004 用藥組0000//對照組1＋00//1005 用藥組0000//對照組0000//1006 用藥組000000對照組000000

3.3 病理學結果

3.3.1 給藥結束 ① 肉眼檢查：各例兔耳皮膚組織未見破潰，無腫脹，無局部紅斑等異常改變；② 鏡下檢查：各例兔耳血管管壁完整，各層組織正常，兔耳血管內皮細胞無腫脹、壞死、脫落，管腔內無血栓形成，管周無充血、水腫、出血和炎細胞浸潤，病理學檢查結果見圖1。

圖1 給藥結束時給藥部位及周邊組織病理學檢查（HE，×200）Fig 1 Histopathological examination of administration sites and surrounding area after administration（HE，×200）

3.3.2 恢復期 ① 肉眼檢查：各例兔耳皮膚組織未見破潰，無腫脹，無局部紅斑等異常改變；②鏡下檢查：各例兔耳血管管壁完整，各層組織正常，血管內皮細胞無腫脹、壞死、脫落，管腔內無血栓形成，管周無充血、水腫、出血和炎細胞浸潤，病理學檢查結果見圖2。

圖2 恢復期給藥部位及周邊組織病理學檢查（HE，×200）Fig 2 Histopathological examination of administration sites and surrounding tissues during recovery（HE，×200）

4 討論

2017年國際抗癲癇聯盟將癲癇發作類型分為全面性、局灶性和其他三類。癲癇發作時患者會出現運動及意識障礙、抽搐、嚴重時意識喪失，治療不及時會影響生命安全。口服給藥時，藥物經胃腸道吸收，存在首過效性，生物利用度較低，不能達到快速控制病情的效果。而且，大部分患者癲癇發作時無法經口給藥。而注射劑直接入血，生物利用度高，起效迅速，可以在癲癇發作時及時控制病情，保證患者的生命安全。

左乙拉西坦已上市多年，其有效性和安全性已在臨床中得到充分驗證。動物實驗發現左乙拉西坦在大鼠腦組織中有一個立體選擇性、飽和的神經元結合位點，而且該結合位點是參與了囊泡胞吐調控的突觸囊泡蛋白2A（SV2A）。雖然人們暫未獲知左乙拉西坦與SV2A 相結合的具體意義，但其在抗癲癇聲源性模型（ASG）中表現出與SV2A 親和力相關，因此左乙拉西坦的抗癲癇作用機制可能與SV2A 結合有關。

左乙拉西坦注射液為患者口服給藥暫不可行時的替代產品，成人患者最大日推薦給藥劑量為3000 mg，每日兩次，每次1500 mg。每次給藥前取左乙拉西坦注射液（規格：500 mg/5 mL）3 瓶溶解在100 mL 的溶劑中，配制最終質量濃度為13 mg·mL，然后在15 min 內注射完畢。臨床用藥中，通常需將不同量的藥物溶解在100 mL 溶劑中，但兒科患者的給藥容量較小，稀釋后的最終質量濃度不應超過15 mg·mL。考慮到臨床常用劑量及給藥方法，此次血管刺激性研究的濃度以成人患者臨床擬給藥質量濃度為依據，確定為13 mg·mL。

UCB Pharma S.A.公司研制的左乙拉西坦注射液（原研藥物）的刺激性研究顯示了其具有良好的耐受性，該研究連續5 d 對家兔靜脈注射質量濃度為15 mg·mL的左乙拉西坦注射液，組織病理學檢查發現，有家兔在給藥部位出現表皮增生、炎癥及出血現象，研究者認為該現象與給藥方法和給藥濃度有關，有可能由正常操作引起。本次研究連續 3 d 對家兔耳緣靜脈注射質量濃度為13 mg·mL的左乙拉西坦注射液（仿制藥），同樣有家兔在給藥部位出現輕微紅斑，但給藥結束后72 h 已經恢復正常，由于對照組也有家兔出現了輕微紅斑，因此該現象極有可能是操作引起的物理性損傷，而非藥物本身的藥理作用。因此，仿制藥左乙拉西坦注射液按給藥劑量為150 mg/（kg·d），每日2 次，連續3日，對家兔耳血管未見明顯的刺激性作用，與原研藥物相關研究結果相似，符合2014年國家藥品監督管理局藥品審評中心頒布的《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》，可用于上市注冊申請。