牡蠣精氨酸激酶過敏原小鼠過敏模型的建立與分析

趙曉涵,李國明,程青麗,馮曉文,盧知浩,張新雪,谷瑞增,劉文穎*,唐艷斌

1(中國食品發酵工業研究院,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)2(中國疾病預防控制中心營養與健康所,國家衛生計生委微量元素重點實驗室,北京100050)

在主要的過敏食物中,貝類、魚、花生和堅果更有可能引發危及生命的全身過敏反應[1]。貝類過敏在西方國家中很常見,且逐漸在亞洲部分地區的兒童和成人中變得普遍[2]。目前已發現6種貝類過敏原,包括原肌球蛋白、肌漿鈣結合蛋白、精氨酸激酶、磷酸丙糖異構酶、肌漿蛋白輕鏈和肌鈣蛋白[3-7]。抗原首次進入機體后會誘導B細胞產生免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗體,IgE與肥大細胞表面的FcεR I受體結合,使機體處于致敏狀態。當機體再次暴露于相同抗原時,致敏細胞上的IgE會與其結合并導致肥大細胞脫顆粒,釋放組胺、類花生酸、蛋白酶和其他趨化和促炎細胞因子等炎癥介質,這些介質會募集白細胞,同時引起平滑肌收縮、血管擴張、黏液高分泌和血管通透性增加等生理病理學變化,這也是過敏癥狀的發病機制[8-9]。有證據表明,牡蠣的攝入、皮膚和黏膜接觸以及霧化牡蠣蛋白的吸入可導致患者出現多種臨床癥狀[10-12],而牡蠣中的精氨酸激酶(arginine kinase,AK)也被驗證為過敏原。

過敏原致敏性可以通過比較序列同源性、IgE結合、血清檢測、消化率和穩定性來評估,目前蝦、蟹等過敏原的研究主要集中在這些方向,但合適的動物模型能更直接地確定蛋白質的過敏反應[13],但至今未見牡蠣AK動物致敏模型的相關報道。過敏食物評價的常用動物模型有BALB/c小鼠、棕色挪威大鼠、豚鼠等,BALB/c小鼠體積小,繁殖周期短,過敏原刺激后偏向Th2型細胞應答且可以產生高效價的IgE,所以選擇該品系小鼠為IgE介導過敏反應的研究對象[14-15]。小鼠的給藥途徑包括口服灌胃、腹腔注射和表皮致敏,口服灌胃能更好地模擬人體經口攝入食物過敏原的實際情況,不過容易誘導免疫耐受。研究發現霍亂毒素會使IL-4、IL-5顯著上升,而IL-2、IFN-γ基本無變化,并且能選擇性發生以Th2為主的過敏反應,所以將它作為黏膜佐劑可有效克服耐受現象[16]。綜上所述,本實驗利用提取純化的牡蠣AK和無毒的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit,CTB)致敏雌性BALB/c小鼠,通過觀察BALB/c小鼠的全身主動過敏反應及體重,測定其血清中總IgE(tIgE)、特異性IgE(sIgE)水平和血漿中血項含量的變化,對空腸、肝臟、脾臟和腎臟進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后觀察病理變化,對空腸進行甲苯胺藍染色來觀察肥大細胞脫顆粒情況,初步建立牡蠣AK BALB/c小鼠過敏模型,為理解貝類過敏的有關免疫機制和研發預防及治療食物過敏的藥物及治療策略提供有價值的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雌性BALB/c小鼠,6周齡,30只,維通利華動物公司,許可證號為SYXK(京)2017-0033；牡蠣AK經過提取純化獲得；小鼠IgE酶聯免疫試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgE、抗凝劑EDTA-K2、TMB顯色液、重組霍亂毒素B亞基,碧云天公司。以下所有實驗得到中國食品發酵工業研究院福利倫理委員會的批準(批準文號：2019—0002)。

1.2 實驗方法

1.2.1 BALB/c小鼠的致敏

雌性BALB/c小鼠適應1周后將其隨機分為實驗組(20只)和PBS對照組(10只),致敏前取血作為陰性血清。使用口服灌胃與腹腔注射牡蠣AK兩種方式對實驗組小鼠進行致敏(如圖1)：在第0、8、16、24、32、40天,實驗組每只灌胃含有10 μg CTB及600 μg AK的200 μL PBS進行致敏；在第4、12、20、28、36天腹腔注射200 μL相同劑量的AK和CTB。在第45天用6 mg/mL的AK(200 μL)分別進行灌胃和腹腔注射激發。對照組灌胃等體積PBS(pH 7.4),步驟相同。分別于第16、28、36、40、45天內取血,離心收集血清,用于檢測tIgE、sIgE；同時于第16、36、45天取血于7.5% EDTA-K2抗凝管中,離心收集血漿并冷凍于-80 ℃,用于測定血項水平的變化。

圖1 BALB/c小鼠的致敏流程

1.2.2 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應評估

在第45天通過灌胃和腹腔注射高濃度牡蠣AK進行激發,激發后20～60 min進行體溫測量,仔細察看小鼠全身過敏反應現象,同時根據過敏評分表(表1)確定其表型過敏級數[17-18]。

表1 過敏反應級數

平均過敏級數達到2級即確定發生表型過敏反應。平均反應級數和過敏率按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

1.2.3 BALB/c小鼠體重和血項指標變化

致敏期間每2周稱體重,計算平均體重。第16、36、45天分別取血于含有抗凝劑EDTA-K2的抗凝管中,使用血細胞分析儀對血漿中白細胞、中性粒細胞和嗜酸性細胞這3種血項指標進行計數。

1.2.4 tIgE、sIgE水平的檢測

利用間接酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測量BALB/c小鼠血清中sIgE,用質量濃度為50 μg/mL的牡蠣AK包被96孔板,4 ℃孵育過夜；添加300 μL/孔的5%脫脂奶粉(質量分數,下同)37 ℃封閉1 h；再取100 μL 2%脫脂奶粉稀釋的BALB/c小鼠血清(1∶5)加入孔中,室溫下孵育3 h；每孔添加100 μL HRP標記的山羊抗小鼠IgE(1∶2 000),37 ℃孵育1 h；用200 μL TMB避光孵育20 min,然后添加50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液終止反應,用酶標儀于450 nm測量OD值。每兩步之間都用PBST洗滌4次,所有實驗均重復3次。使用ELISA試劑盒對BALB/c小鼠血清tIgE水平進行測定。

1.2.5 BALB/c小鼠臟器、腸道病理學分析

第45天激發采血后,處死小鼠,取其空腸、肝臟、脾臟、腎臟,放入10%的多聚甲醛固定后修剪；用不同濃度梯度的乙醇進行脫水處理,石蠟包埋后切片并進行HE染色,用顯微鏡觀察組織形態；空腸甲苯胺藍染色后觀察其肥大細胞脫顆粒現象。

1.2.6 統計學分析

使用統計軟件SPSS及OriginPro 8.0處理實驗數據,組間檢驗采用t檢驗,P<0.01差異極顯著(用**表示)；P<0.05差異顯著(用*表示)。

2 結果與分析

2.1 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應結果

圖2 BALB/c小鼠的過敏反應級數

2.2 BALB/c小鼠體重和血項指標變化

2.2.1 BALB/c小鼠體重變化

體重變化情況如圖3所示,所有BALB/c小鼠體重均逐漸增長,但與對照組相比,實驗組體重增加緩慢。在0～14 d內差異不明顯,之后實驗組小鼠體重明比對照組輕,第42天兩者平均體重差約0.5 g。這可能是因為過敏反應使其消化吸收系統功能紊亂,影響了小鼠的健康狀態,所以體重增長趨勢平緩。

圖3 BALB/c小鼠體重變化

2.2.2 BALB/c小鼠血項指標變化情況

當同種過敏原再次進入處于致敏狀態的機體時,機體內細胞會隨之產生相應的應激反應,從而引起白細胞數目及分類的變化。白細胞是不均一的細胞群,按照其形態、功能和來源部位分為：粒細胞、單核細胞和淋巴細胞,粒細胞包括中性粒細胞(桿狀核及分葉核)、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞,不同類型的白細胞以不同形式在機體中發揮防衛作用[19]。從表2可知,隨著致敏時間的增加,實驗組小鼠白細胞數量也逐漸增加,而對照組基本無變化,在第36、45天呈現出顯著性升高,這說明BALB/c小鼠在免疫期間一直處于過敏狀態。實驗組中性粒細胞在第45天呈現出顯著差異,嗜酸性粒細胞在第36天開始呈現出極顯著差異,這兩種粒細胞數量整體呈增加趨勢。嗜酸性粒細胞在過敏反應中具有調節作用,該細胞會釋放有毒的顆粒蛋白和脂質介質,引起組織損傷和功能障礙,加劇炎癥反應,但也能吞噬抗原抗體復合物[20]。這3種血項指標的變化也進一步說明了實驗組BALB/c小鼠對AK產生過敏反應。

表2 BALB/c小鼠血項指標變化

2.3 血清中tIgE、sIgE的含量變化

2.3.1 血清中tIgE的含量

I型過敏機制由IgE介導,如圖4所示,隨著免疫時間的增加,實驗組小鼠體內tIgE水平也不斷升高,對照組基本維持在11 μg/mL左右。與對照組相比,第28天實驗組的tIgE含量開始明顯增加,之后呈上升趨勢,到第45天激發后實驗組血清中tIgE水平達到41.06 μg/mL,幾乎是對照組的4倍。此外,與第16天比較后,實驗組第45天tIgE含量表現出極顯著的升高。免疫期間實驗組tIgE不斷增加,對照組不變,證明實驗組BALB/c小鼠處于較嚴重的過敏狀態。

圖4 BALB/c小鼠血清總IgE含量

2.3.2 血清中sIgE水平測定

血清中sIgE含量是評價過敏原致敏性的重要檢測指標。圖5顯示的是BALB/c小鼠在不同階段的血清sIgE水平變化情況,通過對血清sIgE抗體的檢測,能夠確定引發過敏反應的過敏原種類和致敏效果。從第16天到第45天,實驗組sIgE抗體含量逐漸升高,且明顯高于正常值。在激發實驗后,與對照組sIgE含量相比有顯著提高。因此,BALB/c小鼠的過敏反應是由牡蠣AK引起的。

圖5 BALB/c小鼠的sIgE變化

將牡蠣過敏患者血清與BALB/c小鼠致敏血清的sIgE含量相比(圖6),發現患者、小鼠的致敏血清與對照組對比后都出現極顯著增加,但患者和鼠的過敏血清無顯著性差異,從而成功獲得其種屬特異性AK致敏血清。

RC-對照組BALB/c小鼠血清；R-實驗組BALB/c小鼠血清；HC-正常人血清；H-對牡蠣過敏的人血清

2.4 組織病理學染色分析

空腸、脾臟、肝臟、腎臟的組織切片如圖7所示,對照組小鼠各臟器組織結構正常,基本無明顯病理改變(圖7-a1～圖7-d1)。實驗組肝臟中央靜脈和肝竇都明顯擴張充血,一些肝細胞索斷開、收縮且使血液相互融合從而產生淤血帶(圖7-a2)。實驗組腸絨毛上皮脫落、紊亂,腸黏膜間質中炎細胞局部浸潤,血管充血水腫,組織疏松(圖7-b2)。有研究發現,在鼠灌胃致敏模擬食物過敏中,其腸道產生過敏癥狀,慢性炎癥導致屏障功能的調節和上皮滲透性的增加,小腸組織造成損傷,從而使腸道攝取更多的免疫完整的大分子[21]。實驗組脾臟紅髓部分充血,邊緣竇有許多淋巴灶(圖7-c2)。模型組腎臟患腎小球炎,血管球成分葉狀,基底膜稍有增厚,炎癥細胞增加(圖7-d2)。這也許是因為過敏反應產生許多嗜酸性粒細胞,進入腎臟后使BALB/c小鼠的器官發生病變。

a-肝臟HE染色；b-空腸HE染色；c-脾臟HE染色；d-腎臟HE染色；e-空腸甲苯胺藍染色；1-對照組；2-實驗組

空腸組織經甲苯胺藍染色后如圖7-e所示,肥大細胞顆粒呈藍紫色,胞核為藍色。對照組的小鼠腸道(圖7-e1)固有層肥大細胞較少、胞膜完整、輪廓清晰,只有很小一部分脫顆粒,而模型組的腸(圖7-e2)固有層肥大細胞增加,很多肥大細胞脫顆粒后胞膜破損、輪廓模糊。肥大細胞是I型過敏反應的重要效應細胞,IgE由B細胞受抗原刺激后分泌,肥大細胞表面的FcεR I受體能夠結合IgE的Fc片段,當抗原再次入侵時,IgE的Fab片段識別和結合抗原,抗原、IgE和FcεR I之間的交聯導致肥大細胞釋放顆粒[22-23]。所以肥大細胞脫顆粒是過敏反應研究的主要階段,其數量及脫顆粒情況能夠良好的反映組織過敏情況。病理觀察表明實驗組BALB/c小鼠空腸已產生明顯的過敏現象。

3 結論

由于經濟全球化和人類飲食結構的改變,牡蠣引起的過敏性疾病發病率正逐漸增加,這對人們的身體健康和生活質量形成了極大的威脅。本研究利用天然牡蠣AK通過經口灌胃與腹腔注射結合并添加CTB佐劑的方式致敏BALB/c小鼠,同時從表型過敏級數、體重方面證明實驗組小鼠已產生過敏反應,而且也許因為過敏反應使臟器受到損傷影響了小鼠的消化吸收,導致部分體重比對照組低,實驗組血項指標均呈現升高趨勢。另外,免疫期間模型組tIgE和sIgE水平也顯著增多,組織病理學分析結果說明模型組臟器均出現組織損傷,空腸肥大細胞脫顆粒現象嚴重。本實驗成功建立并分析了牡蠣AK小鼠致敏模型,獲得了AK動物致敏血清,并從整體動物水平和形態學角度證明了牡蠣AK的致敏性。通過AK建立BALB/c小鼠致敏模型對研究食物過敏的致敏機制及臨床上預防及治療食物過敏具有重要的理論意義。接下來將建立細胞模型并對Th2型淋巴細胞水平及其相關細胞因子的質量濃度和通路進行詳細研究。