高產胞外多糖嗜熱鏈球菌的篩選及其直投式發酵劑的應用

周晴晴,李理,俞赟霞,李言郡,余騰斐,張妍,陳蘇

(杭州娃哈哈集團有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司 浙江省食品生物工程重點實驗室,浙江 杭州,310018)

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是指乳酸菌在菌體生長過程中產生并分泌到細胞外、常滲入到培養基中的一種天然高分子聚合物[1]。乳酸菌是公認的安全級(Generally Regarded As Safe,GRAS)、綠色食品微生物,其所產EPS也被認為是安全可靠的,具有多種生物活性,包括抗氧化、抗腫瘤、降血糖、增強免疫力以及調節腸道菌群等[2-5]。乳酸菌EPS在抗氧化方面的優良特性,使其可以作為一種安全、無毒和來源廣泛的天然抗氧化劑,是目前研究的熱點。此外,乳酸菌EPS具有的多種理化特性使其可以作為理想的穩定劑和增黏劑應用于發酵食品中,起到改善乳制品口感、流變學特性和防止乳清析出的作用,使產品更穩定、質地更細膩[6]。

目前從我國傳統發酵食品中分離出的產EPS的乳酸菌有嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)等[7-9]。其中S.thermophilus是鏈球菌屬中唯一可應用在發酵食品中的菌株,是優良的基礎發酵劑。目前高產EPS菌種資源相對匱乏,導致其廣泛的開發和應用受到限制。科學家們也試圖用基因工程的手段構建高產EPS菌株,但目前仍未取得較大進展[10]。

本研究擬從我國傳統發酵食品中分離出高產EPS的乳酸菌,并進行分離提取,對LAB的生物學特性和其產EPS的抗氧化特性進行分析,同時探索乳酸菌制備的直投式發酵劑(directed vat set,DVS)在發酵乳中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分菌樣品酸奶、奶疙瘩、牦牛奶、駱駝奶、酥油、發酵面團、泡菜等采自于新疆、西藏、貴州、青海和四川等地。

MRS培養基,廣東環凱微生物科技有限公司；M17培養基,青島海博科技工業園生物科技有限公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司；API 50 CH碳水化合物鑒定試劑條、厭氧袋,法國生物梅里埃股份有限公司。

脫脂乳培養基：脫脂乳粉120 g,蔗糖20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水840 mL,均質,105 ℃滅菌10 min。

1.2 儀器與設備

KB240生化培養箱,德國Binder公司；高速冷凍離心機,Eppendorf 股份公司；OLYMPUS BX61光學顯微鏡,Olympus 株式會社；FE20數顯pH計,梅特勒-托利多公司；MyCyler PCR儀,Bio-RAD公司；DU800 紫外分光光度計,Beckman公司；DV2T黏度計,BROOKFIELD公司；AFL-W15A 乳品發酵監控儀,AMS Alliance iCinac公司；Bioscreen全自動生長曲線分析儀,Bioscreen公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離純化

取5 mL(或g)待分離樣品加入裝有45 mL生理鹽水的藍蓋瓶中,攪拌混勻后,用生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度,振蕩混勻。取100 μL混勻樣品液,分別涂布于MRS和M17培養基平板,37 ℃厭氧培養48 h。挑選具有乳酸菌特征的菌落,于平板上反復三區劃線,獲得純菌株,于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 發酵性能優良菌株的篩選

菌株活化2代后,以2%(體積分數)接種量接種于100 mL脫脂乳培養基,37 ℃靜置培養至脫脂乳凝固,觀察并記錄凝乳狀態。對得到的酸乳進行評價,評價指標主要包括組織狀態、拉絲長度、黏度和風味等,篩選出發酵性能優良菌株。

1.3.3 產EPS菌株的篩選

1.3.3.1 EPS的提取和純化

采用劉剛等[11]的方法并稍作修改。菌株活化2代后,以2%(體積分數)接種量接種于脫脂乳培養基中,37 ℃恒溫靜置培養24 h后得到發酵乳。95 ℃水浴加熱發酵乳10 min以除去其中可能降解EPS的酶,冷卻到室溫。8 000 r/min離心30 min后除去細胞和部分蛋白沉淀。向上清液中加入800 g/L的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液至終質量濃度40 g/L,充分攪拌2 h后4 ℃靜置過夜,12 000 r/min 4 ℃離心40 min得到含EPS的上清液。向上清液中加入3倍體積的預冷95%乙醇進行醇沉,4 ℃靜置過夜,離心得EPS沉淀,加純水溶解即得EPS溶液,裝入透析袋中(截留分子質量14 kDa)透析48 h,每8 h換1次水,得到純化EPS溶液。冷凍干燥48 h后,得干燥多糖。

1.3.3.2 EPS含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定EPS的含量[12]。以葡萄糖含量(mg/L)為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線,得到回歸方程：y=0.009 1x-0.011(R2=0.998 4)。同法測得分離菌株所產EPS溶液在490 nm處的吸光度,帶入回歸方程計算EPS產量。

1.3.4 產EPS菌株的鑒定

將菌株于固體培養基劃線,37 ℃培養24 h后,觀察并記錄菌株的形態特征。挑取平板菌落涂布于載玻片并革蘭氏染色,于顯微鏡下觀察菌體的細胞形態。菌株生理生化試驗包括糖發酵特性(API 50 CH鑒定試劑條)、過氧化氫酶試驗、液化明膠試驗、精氨酸水解試驗、硫化氫試驗和吲哚試驗等。

采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒得到菌株DNA,并進行PCR擴增[13],陽性PCR產物送至金唯智生物科技有限公司測序,測序結果在NCBI數據庫中應用BLAST工具與GenBank數據庫進行比對分析。

1.3.5 菌株生物學特性分析

1.3.5.1 菌株生長特性

對菌株的生長特性和產酸特性進行測定。菌株活化2代后以2%(體積分數)接種量接種于M17液體培養基中,40 ℃恒溫靜置培養24 h,采用細胞生長曲線跟蹤儀和酸度跟蹤儀監測菌株生長過程,并繪制菌株的生長曲線和產酸曲線。

1.3.5.2 菌株耐酸耐膽鹽特性

菌株活化2代后,取對數生長末期菌液,離心去上清液,得新鮮菌泥。加入與培養液相同體積的pH值為1.5、2.5、3.5和4.5的M17液體培養基,充分混勻后,置于40 ℃恒溫培養箱中培養4 h,于0、1、2、3和4 h分別取樣,采用稀釋涂布法進行活菌計數計算菌株耐酸性。加入與培養液相同體積的質量分數為0.03%、0.1%、0.2%和0.3%膽鹽的M17液體培養基,充分混勻后,于40 ℃恒溫培養箱中培養24 h,于0、4、8和24 h分別取樣,采用稀釋涂布法進行活菌計數,計算菌株耐膽鹽性。菌株存活率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1,菌株培養后活菌數的對數值；A2,菌株培養0 h活菌數的對數值。

1.3.6 EPS體外抗氧化性能測定

取菌株產EPS樣品,配制成不同質量濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和8.0 mg/mL)的EPS樣品溶液,并以相同濃度的抗壞血酸(維生素C)做陽性對照,按照如下方法分別測定抗氧化指標和總還原力。

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測定

采用WU等[14]方法并稍作修改。試管中加入2 mL EPS樣品溶液,并加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液,混勻后,室溫下于暗處反應1 h,測定517 nm處吸光值。以維生素C作陽性對照。DPPH自由基清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A,以等體積甲醇代替DPPH溶液的吸光度；A0,等體積水替代多糖樣品的吸光度；A1,EPS樣品與DPPH反應后的吸光度。

1.3.6.2 ·OH清除能力的測定

采用Fenton法測定EPS對·OH的清除能力[15]。向含有1 mL 0.435 mmol/L的亮綠溶液,2 mL 0.5 mmol/L的FeSO4和1.5 mL 30 g/L H2O2的Fenton反應體系中加入1 mL EPS樣品溶液,混勻后,37 ℃水浴 20 min,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,取上清液,測定624 nm處吸光值。以維生素C作陽性對照。·OH清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A1,Fenton 試劑+樣品+亮綠溶液體系的吸光度；A0,Fenton 試劑+亮綠的溶液體系吸光度；A,僅含亮綠溶液的吸光度。

(4)

式中：A,只加入Tris-HCl緩沖溶液的吸光度；A0,加入鄰苯三酚溶液的吸光度；A1,終反應吸光度。

1.3.6.4 總還原力的測定

采用鐵氰化鉀法測定EPS樣品的總還原力[17]。取1 mL EPS樣品溶液于試管中,加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS,1 mL 10 g/L的鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴反應 20 min后,驟冷,加入1 mL 5%TCA溶液,混勻,4 000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液,混勻,靜置反應10 min后,測定700 nm處吸光值,以OD700 nm表示EPS樣品的總還原力。OD700 nm值越大,代表還原能力越強。以維生素C作陽性對照。

1.3.7 DVS的制備

菌株于M17液體培養基活化2代后,以5%(體積分數)接種量接種于10 L發酵罐中進行高密度厭氧培養,發酵條件控制為40 ℃、恒pH 6.0,通氣CO2,以發酵液在OD600 nm處的吸光值不變為發酵終點。8 000 r/min、4 ℃離心15 min,棄上清液,收集菌體沉淀。用無菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)漂洗菌體1次,得到的菌泥與脫脂乳、蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉、水等保護劑成分按一定比例充分攪拌混勻。混合液移至真空冷凍干燥機中凍干80 h,得到DVS。

1.3.8 DVS的應用

將脫脂乳粉120 g/L,蔗糖80 g/L溶于55 ℃蒸餾水中,均質,95 ℃滅菌10 min,冷卻。將DVS按最終活菌數為1.0×106CFU/mL的接種量接種于滅菌脫脂乳中,40 ℃靜置培養7 h后,于4 ℃冷藏過夜,得到不需要增稠劑的酸乳。采用AFL-W15A乳品發酵監控儀監測發酵過程pH值變化。對DVS的發酵性能進行分析：采用數顯pH計測定發酵乳pH值；依據GB/T 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》測定發酵乳酸度；采用直尺測定發酵乳拉絲長度(cm)；采用DV2T黏度計測定發酵乳黏度；依據GB/T 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》測定發酵乳活菌數。

1.4 數據統計與分析

每個實驗均設置3次重復,繪圖采用Graph Pad Prism 8軟件,數據分析采用SPSS 17.0軟件,數據以平均值±標準偏差表示,顯著水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 高產EPS菌株的分離、鑒定與保藏

本研究從各種發酵樣品中共分離得到483株乳酸菌。經過發酵性能初篩,篩選出6株黏度高、拉絲長度長且風味良好的菌株(圖1)。其中菌株WHH3379的EPS產量顯著高于其他5株菌,在脫脂乳培養基中的產量為(526.58±2.91)mg/L,高于嗜熱鏈球菌Q4F8的EPS產量[11]。

圖1 菌株胞外多糖產量

WHH3379菌株在M17瓊脂培養基的菌落為圓形,邊緣整齊,略突起,正反面顏色一致,中央與邊緣顏色一致,符合乳酸菌的基本特征(圖2-a)。

顯微鏡下,該菌體呈球形、成對或成鏈狀、無鞭毛、不運動、不產芽孢、革蘭氏染色陽性(圖2-b)。

圖2 WHH3379菌落形態(a)和菌體形態圖(b)

菌株WHH3379可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖3種碳水化合物(表1),不液化明膠,不水解精氨酸,不產硫化氫,過氧化氫酶試驗和吲哚試驗均呈陰性。將菌株WHH3379的16S rRNA基因序列的測序結果在NCBI數據庫中應用BLAST工具與GenBank數據庫已有序列進行比對分析,結果顯示該菌株為嗜熱鏈球菌(S.thermophilus),并將其命名為嗜熱鏈球菌WHH3379。

表1 菌株WHH3379 API 50 CHL發酵實驗結果

嗜熱鏈球菌WHH3379是從青海海晏縣農家自制酥油中分離得到,于2020年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心,微生物保藏編號為CGMCC No.20089。

2.2 WHH3379生物學特性分析

2.2.1 WHH3379生長特性

由圖3可知,嗜熱鏈球菌WHH3379具有良好的生長情況和產酸速率,反映其較高的乳酸菌活力。嗜熱鏈球菌WHH3379從2 h后快速生長進入對數生長期,6 h后即進入穩定期,顯示出較快的生長速率；嗜熱鏈球菌WHH3379在接種2 h后開始大量產酸,pH下降迅速,8 h后趨于平穩,pH為4.10左右,顯示出優良的產酸速率。

a-生長曲線；b-產酸曲線

2.2.2 WHH3379耐酸耐膽鹽特性

益生菌必須以活菌形態到達人體消化道才能更好的發揮其益生功能,而胃部的低pH環境會影響益生菌在腸道的定植[18],所以對酸的耐受性是衡量優良益生菌的重要指標。嗜熱鏈球菌WHH3379的耐酸能力如圖4-a所示,隨著pH值的降低和培養時間的增加,菌株存活率有所降低。但是,在pH為2.5、3.5和4.5的酸度下孵育1 h后菌株存活率均>95%,孵育4 h后菌株存活率仍均>89%。再將pH進一步降低到1.5后,嗜熱鏈球菌WHH3379孵育4 h后仍表現出了(72.85±1.18)%的存活率。從傳統酸奶分離出的鼠李糖乳桿菌217-3在pH 1.5孵育4 h后的存活率為72%,來源于酵素液體的菌株B1在pH 1.5孵育4 h后的存活率為(95.57±3.07)%[19]。正常人體胃液的pH值在1.5～4.5波動變化,菌株可在pH 1.5～4.5維持較高的存活率,表明嗜熱鏈球菌WHH3379具有優良的酸耐受性。

a-酸耐受性；b-膽鹽耐受性

可以耐受人體小腸環境中的膽鹽脅迫是衡量優良益生菌的重要指標,也是益生菌發揮功能的重要前提。嗜熱鏈球菌WHH3379的耐膽鹽能力如圖4-b所示,隨著膽鹽濃度的增加和培養時間的增加,菌株存活率有所下降。嗜熱鏈球菌WHH3379在膽鹽含量為0.03%和0.1%的條件下孵育24 h后菌株存活率仍均>85%,在膽鹽含量為0.3%的環境下培養4、8和24 h后的存活率分別為(90.83±1.05)%、(81.33±3.11)%和(73.41±1.45)%。植物乳桿菌KLDS 1.0318在0.3%膽鹽培養4 h后的存活率仍可達95.40%[18],高于本研究中EPS的清除率。正常人體小腸的膽鹽濃度在0.03%～0.3%波動[19],菌株在膽鹽含量為0.03%～0.3%的條件下能夠維持較高水平的存活率,表明嗜熱鏈球菌WHH3379具有較好的膽鹽耐受性。

2.3 WHH3379 EPS體外抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

菌株及其產物對DPPH自由基的清除作用可反映其降低過氧化自由基、烷自由基或脂質自由基連鎖反應的能力[21]。如圖5所示,隨著WHH3379 EPS質量濃度的增加,對DPPH自由基清除能力也不斷增加,表現出濃度依賴特征,但始終低于維生素C的清除率,當維生素C質量濃度為1 mg/mL時,清除率即可達到(90.3±1.35)%。當WHH3379 EPS質量濃度為5和8 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率分別為(70.4±1.13)%和(79.9±2.26)%。假腸膜明串珠菌GX-3 EPS在質量濃度為5 mg/mL 時的清除率最大為65.34%[22],德式乳桿菌 EPS在質量濃度為5 mg/mL時的DPPH清除率為68.60%[23],均低于本研究中EPS對DPPH自由基的清除率。

圖5 WHH3379 EPS對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 ·OH清除能力的測定

·OH是最具反應活性和最危險的自由基,可通過活體免疫作用產生,對細胞和生物分子造成嚴重氧化應激損傷,從而導致衰老、癌癥等疾病[24]。如圖6所示,0.2～2 mg/mL質量濃度的WHH3379 EPS對·OH的清除能力>維生素C。當WHH3379 EPS質量濃度為5和8 mg/mL時,對·OH的清除率分別(68.9±0.98)%和(73.6±1.58)%,顯示出良好的抗氧化性。融合魏斯氏菌H2產EPS對·OH的清除能力隨EPS濃度的增加而提高,在5 mg/mL時的清除率為(42.56±0.16)%[16]。

圖6 WHH3379 EPS對·OH的清除能力

圖7 WHH3379 EPS對的清除能力

2.3.4 總還原力的測定

EPS可以通過提供氫原子的方式來阻斷過氧化物的形成,破壞自由基反應鏈,防止氧化損傷,從而達到抗氧化效果。如圖8所示,WHH3379 EPS的總還原力與樣品濃度呈正相關,但始終低于維生素C。WHH3379 EPS在質量濃度為5和8 mg/mL時,其總還原力為(1.234±0.35)和(1.213±0.88),顯著高于戊糖片球菌 SR2-2的EPS[26]。

圖8 WHH3379 EPS總還原力

2.4 DVS的制備和應用

由高產EPS的嗜熱鏈球菌WHH3379制得DVS,平板計數得嗜熱鏈球菌WHH3379凍干菌粉活菌數為1.3×1011CFU/g,達到發酵劑的活性要求。利用DVS發酵7 h得到的酸乳pH值為(4.42±0.15),酸度為(75.00±2.34)°T,拉絲長度可達(28.85±1.24)cm,黏度為(5 486±2.25)mPa·s和活菌數為1.89×108CFU/mL(表2)。該發酵劑生產的發酵乳酸度適宜、產黏性好、感官評價高且后酸化現象不明顯(圖9),可作為一種功能性DVS應用于發酵食品中。

表2 WHH3379的發酵乳特性

圖9 WHH3379發酵乳產酸曲線

3 討論

乳酸菌EPS可作為穩定劑和增稠劑應用于乳品行業,起到改善乳制品質構和口感的作用,此外還具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力及調節腸道菌群等多種益生功能[12]。EPS產量受到菌株類型、培養條件和培養基成分等因素的影響[11]。根據EPS產量可以將乳酸菌分為高產(≥180 mg/L)、中產(120～180 mg/L)和低產(<120 mg/L)EPS菌株[27]。本研究得到的嗜熱鏈球菌WHH3379利用脫脂乳基料發酵得到的EPS產量為(526.58±2.91)mg/L,說明嗜熱鏈球菌WHH3379是1株高產EPS的乳酸菌。

發酵乳具備的營養和益生功能越來越受到消費者的青睞,其市場需求量的增加也對相應發酵劑的穩定性和功能性提出要求。優良的發酵劑應該具有產酸快、產黏高、后酸化穩定和活菌數高等特點。本研究中由嗜熱鏈球菌WHH3379制備的DVS得到的發酵乳黏度高,組織狀態好,后酸化平緩,拉絲長度為(28.85±1.24)cm,黏度為(5 486±2.25)mPa·s,酸度為(75.00±2.34)°T和活菌數為1.89×108CFU/mL,同時嗜熱鏈球菌WHH3379 EPS又具有抗氧化功能,可作為一種功能性DVS應用于發酵食品中。

4 結論

本研究從青海農家自制酥油樣品中分離得到1株高產EPS乳酸菌,經形態學鑒定、生理生化實驗和分子生物學實驗,鑒定該菌株為S.thermophilus,命名為嗜熱鏈球菌WHH3379,微生物保藏編號為CGMCC No.20089。以嗜熱鏈球菌WHH3379為出發菌株利用脫脂乳基料發酵,EPS產量為(526.58±2.91)mg/L。研究發現嗜熱鏈球菌WHH3379具有良好的耐酸耐膽鹽特性,且其產EPS具有良好的抗氧化活性。此外,由嗜熱鏈球菌WHH3379制得的DVS具有優良的發酵特性,得到的發酵乳黏性高、質構細膩。因此,嗜熱鏈球菌WHH3379作為高產EPS并具有益生功能的乳酸菌發酵劑具有廣闊的工業應用前景。