蛹蟲草發酵產蟲草素工藝優化

唐成倫,王松濤,趙南,鄒亞男,陳勇,劉慶國*,劉淼

1(南京高新工大生物技術研究院有限公司,江蘇 南京,210032)2(瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)3(南京工業大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京,210032)

蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素,是一種腺苷類物質,別稱3′-脫氧腺苷[1]。蟲草素是蛹蟲草的主要有效成分,具有抗腫瘤、抗炎癥、抗輻射、抗氧化、降血壓、抗衰老、提高免疫力和改善記憶等功能[2-5]。蟲草素制備方法主要有生物發酵法和化學合成法。化學合成主要以腺苷或其衍生物為原料合成3′-脫氧核糖環鹵代物,最后加氫脫鹵制取。合成過程復雜反應苛刻、成本高、產率低,且反應過程中產生大量有機廢液對環境造成不良影響,因此難以工業化生產[6]。發酵法是由蛹蟲草液體或者固態培養,并經過膜分離及樹脂純化獲得。固態培養生產周期長(50～60 d)、不易控制、產量低、勞動量大,不能滿足工業原料需求。液體發酵生產周期短(15～25 d)、易于控制、產量高、應用潛力大[7-9]。

目前關于蟲草素液體發酵的研究主要集中于育種和培養基優化。張楠等[10]以蛹蟲草NS-810為菌種,通過單次單因素試驗和正交實驗,優化深層發酵產蟲草素的最佳培養基,其配方為葡萄糖、土豆、魚蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、蠶蛹粉、維生素B1,優化后蟲草素的總產量為1.14 g/L,較基礎培養基提高了1.46倍。鄭威等[11]在基礎培養基為小米、葡萄糖、白糖、KH2PO4、MgSO4、蛋白胨、酵母浸膏、氨基酸條件下,分析了不同培養條件對蟲草素合成的影響,結果發現擬青霉在溫度21 ℃、38 h、維生素B1添加量0.08 g/L 時,擬青霉A20140822 發酵生產蟲草素質量濃度最高達到1.465 g/L,比對照提高20%以上。MASUDA等[12]研究添加腺苷和腺嘌呤等對蛹蟲草NBRC9787產蟲草素發酵的影響,與對照組相比,蟲草素濃度提高了15%。SHIH等[13]通過對蟲草素生產工藝的優化設計,確定了生產蟲草素的最佳工藝條件即在pH 6、酵母膏質量濃度為45 g/L,振蕩培養8 d、靜態培養16 d,蟲草素的最大產量為2.2 g/L,明顯高于未優化前的靜態培養發酵水平。DAS等[14]利用突變體G81-3為發酵菌株,采用中心復合設計的響應面分析,得到最佳碳源為葡萄糖,質量濃度86.2 g/L,氮源為酵母提取物,質量濃度93.8 g/L,蟲草素產量為6.84 g/L,是對照的2.79倍。雖然關于培養基優化的研究很多,但多局限于培養基的設計層面。對深層發酵和規模放大工藝少有研究。本論文在前期研究基礎上[15]進一步探討工藝放大可行性,為工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

CordycepsmilitarisCGMCC 18581由CICC14014誘變所得,現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 試劑

甲醇、葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、NaCl,國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨(食品級),河南信和生物科技有限公司；酵母粉,安琪酵母股份有限公司；腺嘌呤、蟲草素,上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養基

固體培養基(g/L)：土豆汁200,復配葡萄糖20,MgSO41,瓊脂20,pH不調控。

種子培養基(g/L)：葡萄糖28,酵母膏15,蛋白胨20,KH2PO40.5,K2HPO420.5,MgSO41,用稀鹽酸調pH至5.8。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖28,酵母膏15,蛋白胨20,KH2PO40.5,K2HPO420.5,MgSO41,吐溫-80 0.5,腺嘌呤4,用稀鹽酸調pH至5.8。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜,安捷倫科技(中國)有限公司；752 N分光光度計,上海儀電有限公司；XSP10顯微鏡,萬衡儀器有限公司；SX-700立式全自動滅菌鍋,TOMY公司；ZQZY-CF振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1BU超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；定制多層反應器,迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基

菌株平板活化：將保藏的蛹蟲草菌株轉接至固體培養基,26 ℃培養6 d。

搖瓶種子培養：搖瓶培養作為一級種子培養(擴培次數定義為0),500 mL三角瓶裝液量100 mL,121 ℃滅菌后降至常溫保壓。將平板菌絲體刮入搖瓶中。180 r/min、26 ℃培養2～3 d。

發酵罐種子培養：10 L攪拌罐培養作為2級種子培養(擴培次數定義為1,后續擴培均在10 L玻璃罐基礎上進行擴培),裝液量50%,121 ℃滅菌后降至常溫保壓。將搖瓶菌種通過火焰圈接種至種子罐。120～400 r/min、通氣量6～10 L/h、26 ℃培養48～120 h。

搖瓶發酵培養：種子罐接有空消過的空補料瓶,通過壓差將培養好的種子壓入空瓶中,并在超凈臺中,按10%接種量接種至裝有發酵培養基三角搖瓶中,26 ℃下靜置發酵25 d。

發酵罐(多層反應器)發酵：按15%接種量接入裝有35 L無菌發酵培養基的50 L發酵罐,混合后,通過壓差和溢液方式裝滿無菌多層反應器,26 ℃、通氣量1 000 L/h、壓力0.07 MPa條件下發酵25 d。

1.3.2 分析方法

蟲草素檢測：取發酵液離心后上清液稀釋20倍,0.22 μm濾膜過濾,得到待測樣品液。采用液相色譜法測定蟲草素含量。色譜條件：色譜柱Sepax HP-C18；檢測器：紫外;波長254 nm；柱溫30 ℃；流動相：甲醇∶KH2PO4(1.36 g/L)=25∶75；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。以外標峰面積法進行定量分析。

生物量測定：發酵液離心后,用純水洗滌3次,最終離心沉淀物置于80 ℃烘箱干燥至恒重,沉淀物干重與發酵液比值定為生物量濃度。

菌體形態檢測：通過顯微鏡觀察,物鏡40倍。

底物轉化率P按公式(1)計算：

(1)

式中：Cc,蟲草素質量濃度,mg/mL；Ca,腺嘌呤質量濃度,mg/mL；Vi,發酵初體積,mL；Vt,發酵終體積,mL；1.86,理論轉化率,即1 g腺嘌呤理論產1.86 g的蟲草素。

采用Origin 8.1進行數據統計分析及作圖,蟲草素合成曲線用公式(2)所示數學模型：

(2)

式中:y,蟲草素質量濃度,g/L;x,發酵時間,d;A1、A2和p為擬合常數。

2 結果與分析

2.1 種子質量對發酵的影響

2.1.1 轉速影響

在維持溶氧不低于30%基礎上,分別分析了不同轉速對種子培養的影響。在較低轉速下,菌絲生長速率相對較慢,直至發酵終點,菌體一直呈上升趨勢(圖1)。隨著轉速提高,前期菌體生長速率明顯提升,在高轉速下(400 r/min),培養3 d菌體量可以達到16 g/L以上,但發酵后期有菌體量下降趨勢。

圖1 不同轉速對菌種生長的影響

從圖2-a可知,低轉速下,菌絲體形態較為完整,高轉速下出現自溶現象(圖2-c)。鐘思敏等[16]報道,在蛹蟲草深層動態培養時,轉速對菌體生長形態和產物轉化等有顯著影響,并發現最適轉速為180 r/min,即低轉速對發酵有利。

a-120 r/min；b-250 r/min；c-400 r/min

不同轉速和培養時間下的菌種對蟲草素發酵影響也較為明顯,如圖3所示,在低轉速下,菌種生長周期長,培養5 d的菌種質量較佳。而在高轉速下,培養時間長,菌種活性有明顯下降,對蟲草素合成有顯著影響。因此選擇轉速250 r/min,培養周期3 d為宜,此時菌體質量濃度為14 g/L左右。

圖3 不同培養條件對蟲草素合成影響

2.1.2 接種量影響

如表1所示,接種量小(5%),菌體生物量濃度偏低,即生長速率慢,從而導致蟲草素濃度較低。提高接種量,生物量有明顯提高。當接種量15%時,蟲草素質量濃度達最高值6.03 g/L。

表1 不同接種量對發酵的影響

房天琪[17]的研究也得到類似的結果,接種量為15%～20%時蟲草素濃度相對較高；當接種量提高至25%時,生物量最高達到22 g/L以上,但蟲草素有明顯下降。這可能由于底物往菌體生長途徑轉化。

2.1.3 種子擴培級數影響

由于考慮到后期工藝放大情況,考察了菌種擴培次數對菌種質量的影響。以搖瓶培養定為擴培0次,10 L種子罐培養定為擴培1級,將種子罐培養的種子轉接至另外10 L種子罐培養定為2級,以此類推。每級種子培養終指標為生物量14 g/L左右。從圖4發現,菌種擴培2級后,種子質量對蟲草素合成有明顯影響,尤其在種子擴培4級時,蟲草素濃度下降顯著,這可能與菌種在多次傳代后出現退化有關。所以在工藝放大應用時,菌種擴培次數盡量不超過2次。

圖4 不同擴培級數對蟲草素發酵影響

2.2 裝液高徑比對發酵影響

以高徑比2 cm/15 cm作為對照組,高徑比較大(2 cm/5 cm)時,蟲草素濃度及底物轉化率顯著降低。高徑比較小(2 cm/30 cm)時,蟲草素產量較高,但轉化率沒有提升。這主要由于表面積較大時,水分揮發嚴重,對中后期菌體生長有一定的副作用。另外,在高徑比相似時,液面高度越大,對蟲草素合成影響也越大,尤其當高度>4 cm時,蟲草素和轉化率都有明顯下降。結果說明蟲草素發酵需要較為合適的裝液高徑比,且裝液高度對其發酵影響更大。研究表明,過多的裝液量會導致溶解氧缺乏,不利于菌絲生長和代謝產物合成[18-19]。然而比表面積過大,也不利于蟲草素發酵,除了揮發作用大,其對菌體生長影響也較明顯。SUPARMIN等[20]通過轉錄組學分析深層液體發酵和淺層液體發酵體系的基因表達,發現低溶氧下的淺層液體發酵更有利于蟲草素積累。

表2 不同高徑比對蟲草素發酵影響

2.3 120 L多層反應器驗證

采用以上最佳高徑比的尺寸設計了120 L(實際裝液量40 L)多層反應器,如圖5所示,內部為淺層托盤,直徑40 cm,裝液高度2.7 cm,托盤數量12個。

圖5 120 L多層反應器

接種發酵25 d結果如圖6所示。該曲線采用常規生長曲線模型進行擬合,決定系數R2值為0.985。發酵5 d,幾乎沒有產量,發酵第5～15天蟲草素合成速率明顯提高,尤其在發酵第15～20天時,蟲草素合成速率顯著提高,之后增長速率稍有下降。這主要受生物量合成的影響,即前期菌體生長緩慢,菌體達到穩定期后,產物合成速率明顯提高。

圖6 蟲草素產量隨培養時間的變化

發酵25 d后,發酵終體積31.5 L,蟲草素質量為167.58 g,轉化率57.0%。轉化率稍低于小試結果(裝液高徑比2 cm/30 cm)。這可能與罐內氣體管路設計不科學有關,使得氣體分布效果不理想,從而影響發酵效果。

3 結論與討論

本文首先以發酵生物量和蟲草素產量為指標評估了菌種質量。通過對轉速、接種量和擴培級數等進行優化分析,獲得了最佳條件為：轉速250 r/min,接種量15%,擴培級數1～2次。此條件下的蟲草素發酵產量可達6 g/L左右。其次分析了不同裝液量的高徑比對蟲草素發酵的影響,發現2 cm/30 cm為最適高徑比,以上述最佳條件為依據,進行了120 L多層反應器發酵工藝驗證。結果顯示：發酵25 d,蟲草素產量為5.32 g/L,轉化率為57%,與小試工藝結果較為一致。本實驗證明了工藝放大的可行性,為進一步工業化應用提供了參考