體外模擬消化對海洋魚骨膠原低聚肽結構和抗氧化活性的影響

馮曉文,趙曉涵,潘驍琦,裴晨皓,谷瑞增,劉文穎*

1(中國食品發酵工業研究院,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)2(北京城市學院 生物醫藥學部,北京,100094)

三文魚,也稱為鮭魚或大馬哈魚,主要分布在挪威、加拿大、美國等高緯度地區,因其肉質鮮美,富含維生素A、B、D、E,各種礦物元素以及n-3系列不飽和脂肪酸,對人體健康極其有益,使得我國三文魚市場消費量日益增加[1-2]。三文魚的大量消費伴隨產生大量的副產物三文魚骨。這些數量巨大的三文魚骨或被直接丟棄,或被用作飼料添加物,或用作生產魚粉等附加值很低的產品,造成了三文魚骨資源的嚴重浪費[3]。

課題組前期以三文魚骨為原料,通過酶解法制得海洋魚骨膠原低聚肽,也證明了海洋魚骨膠原低聚肽中蛋白質含量高,具有很好的抗氧化性。此外海洋魚骨膠原低聚肽還具有溶解性好、無副作用、安全性高等優點[4-5]。基于此,本研究以通過酶解制得的海洋魚骨膠原低聚肽為研究對象,通過體外模擬胃腸道消化,利用分子質量分布測定、紫外全波長掃描、圓二色光譜掃描技術表征消化前后海洋魚骨膠原低聚肽結構的變化；通過測定DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、鐵離子還原能力(ferric reduction ability plasma assay,FRAP)、氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)4個抗氧化指標,研究消化前后海洋魚骨膠原低聚肽抗氧化活性的變化。深入研究海洋魚骨膠原低聚肽結構和抗氧化性的消化穩定性,為三文魚骨的高附加值利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

三文魚骨,北京中食海氏生物技術有限公司；無水乙醇、NaOH、濃鹽酸、KH2PO4、Na2HPO4、K2S2O8、醋酸鈉,北京化學試劑公司；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶,諾維信生物技術有限公司；胰蛋白酶,北京Solarbio公司；DPPH、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、Trolox(水溶性維生素E),均為色譜純,胃蛋白酶,美國Sigma公司；ABTS,分析純,南京森貝伽生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪(tripyridine triazine,TPTZ),酷爾化學科技(北京)有限公司；FeCl3、FeSO4,廣東汕頭市西隴化工有限公司。

1.1.2 實驗儀器

YG30型噴霧干燥機,無錫市陽光干燥設備廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋,普瑞斯機械有限公司；FE20K型pH計,瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E超聲波振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司；J-810圓二色譜儀,美國Jasco公司；Spectra MR多功能酶標儀,美國Dynex公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀,美國MD公司；LC-20AD高效液相色譜儀、UV-1780紫外可見分光光度計,日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋魚骨膠原低聚肽的制備

將三文魚骨做潔凈處理,然后經粉碎機制得三文魚骨粉。稱取魚骨粉30 g溶于500 mL蒸餾水中混均,于90 ℃水浴鍋放置10 min,然后迅速降溫到50 ℃,使用pH計調節溶液pH值為8.5,加入堿性蛋白酶反應3 h,反應完畢后收取200 mL反應液；將剩余反應液pH值調至7,維持溫度在60 ℃,加入木瓜蛋白酶酶解2 h。反應完畢后,100 ℃滅酶10 min。待降至室溫后,將上述經不同處理的反應液在10 000 r/min條件下離心30 min,取上清液。用孔徑為200 nm的陶瓷膜過濾,取過濾清液,然后用截留分子質量為1 000 u的超濾膜超濾上清液,超濾過后的上清液進行噴霧干燥,進料溫度25 ℃,進料速度14 mL/min,進風溫度135 ℃,進風壓力20 kPa,得到海洋魚骨膠原低聚肽干粉[6]。

1.2.2 體外模擬胃腸道消化實驗

1.2.2.1 模擬胃液消化實驗

精確稱取50 g海洋魚骨膠原低聚肽干粉溶于1 L超純水中,配制成質量濃度為50 mg/mL的溶液,取20 mL溶液于50 mL離心管中,用1 mol/L HCl溶液調節pH值為2,在37 ℃水浴鍋中加熱1 min,加入3%(酶底比)胃蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續消化3 h,然后沸水浴滅酶活10 min,此為模擬胃液組。另做樣品消化前對照組(未消化組)。待樣品冷卻至室溫后,進行后續實驗[5]。

1.2.2.2 模擬腸液消化實驗

將樣品配制成質量濃度為50 mg/mL的溶液,取20 mL溶液置于50 mL離心管中,調節pH值為6.8,37 ℃水浴加熱1 min,加入3%(酶底比)胰蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續消化3 h,滅酶活10 min,此為模擬腸液組。冷卻至室溫后,進行后續實驗[5]。

1.2.2.3 模擬先胃液后腸液消化實驗

按照1.2.2.1的方法進行胃蛋白酶消化后,調節pH值為6.8,37 ℃水浴加熱1 min,加入3%(酶底比)胰蛋白酶(≥250 units/mg),混勻,于37 ℃水浴鍋中繼續消化3 h,滅酶活10 min,此為先胃后腸組。冷卻至室溫后,進行后續實驗[5]。

1.2.3 分子質量分布測定

分子質量分布采用高效凝膠過濾色譜法測定。色譜條件為：色譜柱：TSKgel G2000 SW XL 300 mm×7.8 mm；流動相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；流速：0.5 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃,紫外檢測器檢測。使用1 mg/mL的樣品溶液進行測定,樣品溶液經流動相配制,然后經孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后,用高效液相色譜儀進行凝膠過濾,數據使用Empower GPC軟件處理。以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質量189 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質量451 u)、桿菌酶(分子質量1 450 u)、細胞色素C(分子質量12 500 u)為肽標準品,配制質量分數0.1%溶液,過膜后進樣,制作相對分子質量校正曲線[4]。

1.2.4 紫外全波長掃描

將質量濃度2.0 mg/mL的樣品溶液置于石英比色皿中,利用紫外可見分光光度計進行紫外全波長掃描,掃描波長245～325 nm,狹縫1.0 mm,采樣間隔0.5 nm,慢速掃描,用Origin Pro 8.5軟件分析處理數據。

1.2.5 圓二色光譜掃描

取質量濃度1.0 mg/mL的樣品溶液置于石英比色皿中,于圓二色光譜儀上進行檢測,設定圓二色光譜條件：光源采用氙燈；氮氣輸出壓力為0.4 MPa；帶寬1.0 nm；光譜測量范圍180～260 nm；步進0.5 nm；數據點采樣時間0.25 s。對蛋白樣品進行圓二色光譜采集,每個樣品采集3次數據,用Origin Pro 8.5軟件分析處理數據,用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件分析蛋白質中二級結構的組成與含量。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定

配制質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL的海洋魚骨膠原低聚肽溶液,分別加入100 μL于96孔板中,再加入100 μL 0.1 mol/L DPPH-無水乙醇溶液,混合均勻后,室溫避光反應30 min,立即利用酶標儀在波長517 nm處測定吸光值AX；以無水乙醇代替DPPH-無水乙醇溶液作為空白組,測定吸光值A0；以蒸餾水代替樣品溶液作為對照組,測定吸光值A1。每個濃度的樣品做3組平行。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示[6-7]：

(1)

1.2.7 ABTS陽離子自由基清除能力測定

使用超純水將ABTS稀釋至7 mmol/L制得ABTS儲備液。將2.45 mmol/L的K2S2O8與ABTS儲備液等體積混合,室溫避光過夜,使其充分反應12～16 h。然后將反應后的ABTS工作母液稀釋35倍得ABTS工作液。取96孔板,于96孔板中各加入200 μL的ABTS工作液,樣品孔每孔加入10 μL的質量濃度1 mg/mL的待測樣品,空白孔加入10 μL,0.1 mol/L,pH 7.4的PBS,標準孔加入不同濃度的Trolox標準溶液,每組試驗做3組平行。然后輕輕晃動96孔板片刻,室溫避光反應5 min,最后在734 nm處測定吸光度(optical density,OD)值。以標準品OD值為縱坐標,Trolox濃度為橫坐標繪制標準曲線,根據標準曲線計算樣品的ABTS自由基清除能力,以mmol Trolox/L表示[8-9]。

1.2.8 FRAP的測定

將300 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液、和20 mmol/L FeCl3溶液按體積10∶1∶1的比例制備得FRAP工作液。將FRAP工作液加熱到37 ℃。取96孔板,每孔加入180 μL的FRAP工作液,空白對照孔加入5 μL的PBS,標準檢測孔中加入5 μL的不同濃度的FeSO4標準溶液,樣品檢測孔內加入5 μL的1 mg/mL待測樣品,輕輕晃動96孔板,混勻。37 ℃孵育5 min,在593 nm處測定OD值,根據FeSO4標準溶液制得的標準曲線計算樣品的FRAP[10]。

1.2.9 ORAC值測定

預先配制好pH 7.4,75 mmol/L PBS,不同濃度的Trolox標準品,0.8 μmol/L的Fluorescein；150 mmol/L AAPH。取96孔板,空白孔中加入25 μL的PBS(pH 7.4,75 mmol/L),對照孔中加入25 μL的PBS,標準溶液孔中加入不同濃度梯度的Trolox標準溶液各25 μL,樣品孔加入25 μL的1 mg/mL的樣品。在避光條件下各孔加入100 μL的0.8 μmol/L Fluorescein,混勻后于37 ℃避光反應20 min。反應完畢,空白孔中加入75 μL的PBS,其余各孔迅速加入75 μL的150 mmol/L AAPH,然后在熒光酶標儀激發波長485 nm,發射波長530 nm條件下,每隔5 min測定1次,測定總時長為180 min。以Trolox標準溶液的濃度為橫坐標和熒光衰減曲線保護面積為縱坐標繪制標準曲線,根據Trolox標準曲線計算樣品的ORAC值,結果表示為μmol Trolox/g[11]。

2 結果與討論

2.1 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的分子質量分布

采用高效凝膠過濾色譜法測定海洋魚骨膠原低聚肽經體外模擬胃腸道液化后的分子質量分布,結果如表1所示,經過不同的消化模式,海洋魚骨膠原低聚肽的組分中分子質量<1 000 u的組分所占比例均有所升高,重均分子量均有所降低,其中模擬先胃液后腸液消化后分子質量<1 000 u的組分增加比例最大(約12.16%)和重均分子量降低最多(約23.95%)。這表明海洋魚骨膠原低聚肽能夠一定程度耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶。與未消化組相比,經過模擬腸液、模擬先胃液后腸液消化后,1 000～2 000 u、2 000～3 000 u、3 000～5 000 u的組分和重均分子量均有所下降,而<150 u的組分所占比例升高。這表明分子質量相對較大的肽段經過消化后分解成小分子質量的肽段或氨基酸。此外,從表1可見,胰蛋白酶對海洋魚骨膠原低聚肽的消化作用要強于胃蛋白酶,這表明胰蛋白酶更易破壞鏈內肽鍵,產生較小的肽段。杜枘宣[12]的研究同樣表明酪蛋白在體外模擬腸液消化中的水解度顯著高于胃液消化。在本研究的3種消化方式中,先經模擬先胃液后腸液消化后,海洋魚骨膠原低聚肽中分子質量<1 000 u的組分升高最多。ZHANG等[13]以全脂大豆片為原料,通過模擬胃腸液消化處理以后,也報道了同樣的多肽水解趨勢,大豆蛋白水解物經先胃后胰處理后,>10 000 u的肽相對含量降低,<1 000 u的肽相對含量同時增加。

表1 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的分子質量分布

2.2 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的紫外全波長掃描

有研究表明,由于蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基含有共軛雙鍵,因此蛋白質溶液在275～280 nm處有1個紫外吸收峰,且其吸收峰值與酪氨酸、色氨酸含量成正比[14]。海洋魚骨膠原低聚肽在分別經模擬胃液、模擬腸液及模擬先胃液后腸液消化之后,對其進行紫外全波長掃描,如圖1所示,海洋魚骨膠原低聚肽消化前后均在275～280 nm附近出現紫外吸收峰,表明在該波長范圍內產生了價電子躍遷,其中未消化組吸收峰最低(吸光值為0.311 0),模擬胃液組吸收峰最高(吸光值為0.415 8),模擬先胃液后腸液消化處理后,與單獨模擬胃液消化處理相比紫外吸收值差異不顯著,前后變化量小于5%。胃蛋白酶的特異識別位點與酪氨酸、色氨酸等相關,表明了海洋魚骨膠原低聚肽經模擬胃液消化以后部分肽鏈發生水解,使得溶液中游離酪氨酸或色氨酸含量增加。

圖1 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的紫外全波長掃描

2.3 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的圓二色光譜掃描

通過圓二色光譜檢測海洋魚骨膠原低聚肽經不同消化酶處理后的二級結構,結果如圖2所示,4組樣品在195 nm附近均有1個負峰,使用CDNN 2.1-Simple Spectra軟件對4組樣品的CD圖進行分析得到相應的二級結構組成,如表2所示。二級結構中,不規則卷曲比例最高,其次是反平行式β-折疊、β-轉角、α-螺旋、平行式β-折疊。與未消化組相比,其余3組反平行式β-折疊比例均減少,其中模擬先胃液后腸液消化后減少最多,為24.12%；同時β-轉角、不規則卷曲的比例增加,α-螺旋、平行式β-折疊消化前后變化不大,與未消化組相比,變化不超過8.33%。不同消化模式下,海洋魚骨膠原低聚肽二級結構的差異可能是胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用位點和機理不同。在不同酶的作用下,海洋魚骨膠原低聚肽的分子間作用力發生改變及肽鏈構象和結構發生了改變[15]。

圖2 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的圓二色光譜圖

表2 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的二級結構 單位：%

2.4 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的DPPH自由基清除能力

海洋魚骨膠原低聚肽經不同消化酶處理后的DPPH自由基清除能力如圖3所示。

圖3 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的DPPH自由基清除活性

海洋魚骨膠原低聚肽對DPPH自由基清除率呈劑量依賴關系,未消化、模擬胃液、模擬腸液及模擬先胃液后腸液消化消化后,海洋魚骨膠原低聚肽對DPPH自由基清除率均隨質量濃度增加而增加,且未消化組與模擬胃液組整體DPPH自由基清除率明顯高于后2組,結合圓二色光譜分析結果,其原因可能是經模擬腸液處理后,海洋魚骨膠原低聚肽具有抗氧化活性的肽段結構和構象部分發生變化,發生了二級結構的相互轉換,導致了抗氧化活性的降低。或者可能是胰酶消化后使得三肽和二肽及氨基酸積累,產生的這些親水性的水解物幾乎不與脂溶性DPPH自由基反應[16]。李茹等[17]以新鮮蘿卜苗為原料,利用胃蛋白酶、胰液素消化產生蘿卜苗中活性物質,探索模擬胃腸道消化對蘿卜苗中活性物質抗氧化活性的影響,其DPPH自由基清除率結果與本研究基本一致。

2.5 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的ABTS陽離子自由基清除能力

以不同濃度的Trolox標準溶液為橫坐標,相應的吸光值為縱坐標,制得ABTS標準曲線為y=0.670 22x+1.188 14(R2=0.998 73)。根據標準方程可得各處理組的ABTS陽離子自由基清除率,結果如表5所示,與未消化組相比,其余3組ABTS陽離子自由基清除能力均有一定程度的增加,但均無顯著影響(P>0.05),這表明海洋魚骨膠原低聚肽的ABTS陽離子自由基清除能力具有一定的消化穩定性。模擬胃腸液消化后,海洋魚骨膠原低聚肽的ABTS陽離子自由基清除率稍有提高的原因可能是其經模擬胃、腸液消化處理后,產生了較多的親水性的肽段和氨基酸,具有抗氧化活性的氨基酸殘基更加充分暴露,使得產生的ABTS陽離子自由基更容易被抑制,因此與未消化組相比,經蛋白酶消化后的ABTS陽離子自由基清除能力有所提高[16]。顧敏[18]對青養蛋白抗氧化肽經凝膠過濾色譜分離組分的胃腸道消化特性進行了研究,結果與本研究一致,體外胃腸道消化體系均提高了其抗氧化活性。

表3 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的ABTS陽離子自由基清能力

2.6 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的FRAP值

通過計算可得FRAP標準曲線表達式：y=0.276 4x+0.011 4,R2=0.994 3。根據標準曲線表達式及所測樣品OD值,可得相應的FRAP值,如表4所示。經過模擬胃腸液消化處理后,海洋魚骨膠原低聚肽均具有一定的鐵離子還原能力,這表明海洋魚骨膠原低聚肽能夠通過氫原子轉移阻斷自由基鏈式反應過程實現抗氧化作用[19]。與未消化組相比,不同方式處理后的FRAP值無顯著差異(P>0.05)。SILVA等[20]以亞麻籽粕為原料,通過不同蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽,結果表明,分子質量較低的亞麻籽粕肽的FRAP值較高,可能是由于其包含某些活性氨基酸序列,或者具有大量疏水區的肽段特定結構,從而提高抗氧化活性。模擬人體胃腸液消化模式下,能夠將海洋魚骨膠原低聚肽酶解成更小分子質量的肽段,使得一些疏水性基團進一步暴露出來,導致表面疏水性提高,而高含量的疏水性氨基酸或肽通常與較高自由基清除活性有關。

表4 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的FRAP值

2.7 消化前后海洋魚骨膠原低聚肽的ORAC

不同濃度Trolox標準液的動態熒光衰減曲線如圖4所示,由此繪制Trolox標準曲線方程為：y=0.019 5x+1.455 8(R2=0.997 6)。根據標準曲線表達式可得未消化組、模擬胃液組、模擬腸液組以及先胃后腸組,海洋魚骨膠原低聚肽的ORAC值如圖5所示。體外模擬消化顯著提高海洋魚骨膠原低聚肽的ORAC值(P>0.05)。

圖4 不同濃度Trolox的動態熒光衰減曲線

圖5 不同處理的海洋魚骨膠原低聚肽的ORAC值

推測原因可能是海洋魚骨膠低聚肽經胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后,暴露出更多活性基團,大大增加與自由基反應的機會,從而增強對自由基的清除能力,有利于進一步提高海洋魚骨膠原低聚肽的抗氧化活性[21]。已知分子質量較小的肽段往往具有較高的抗氧化活性,吳明澤等[22]以中華圓田螺肉酶解產物為研究對象,證明了分子質量<1 000 u組分的ORAC值顯著高于分子質量較大的組分(P<0.05)。本研究中,海洋魚骨膠原低聚肽經模擬胃、腸液消化處理后分子質量分布范圍主要集中于<1 000 u的短肽,這可能與其具有較高的ORAC值有關。

3 結論

通過模擬胃、腸液處理海洋魚骨膠原低聚肽,分子質量分布結果表明海洋魚骨膠原低聚肽能夠在一定程度上耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶作用。紫外全波長掃描結果顯示4組樣品在275～280 nm處吸收峰有差異,表明海洋魚骨膠原低聚肽含有酶解特異序列。圓二色光譜結果顯示了4組樣品的反平行式β-折疊差異顯著,同時4組間β-轉角、不規則卷曲含量發生了相應的變化,表明了酶解使得海洋魚骨膠原低聚肽分子間作用力發生改變及肽鏈構象和結構發生了改變。DPPH自由基清除能力經模擬胰液消化后有一定程度的降低,ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP值及ORAC值,三者經模擬胃、腸液處理之后,抗氧化能力或有一定程度的提高或者保持穩定,4個抗氧化指標結果總體表明海洋魚骨膠原低聚肽的抗氧化活性具有抗消化穩定性。后續將進一步篩選出特定的具有消化穩定性的抗氧化活性肽段,以期為海洋魚骨膠原低聚肽在新型抗氧化功能食品的開發及應用提供理論基礎。