不同脫腥方法對海參腸卵酶解液脫腥效果的比較

陳增鑫,劉詠霖,潘蕓蕓,姜竹茂*,洪杏德

1(煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺,264005)2(山東承錦海洋生物科技有限公司,山東 煙臺,264000)

海參屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothurian),是一種重要的海洋無脊椎生物[1-2]。海參加工過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物如海參腸、海參卵等,此類副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值極高,富含人體所需的蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、微量元素等,具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、提高免疫力等功效[3],如直接丟棄會造成資源浪費和環(huán)境污染[4-5]。研究表明,酶解是一種可高效利用海參腸卵中營養(yǎng)成分的方法,得到易于吸收、具有保健及藥用功能的蛋白多肽水解物,創(chuàng)造顯著的經(jīng)濟和社會效益[5-7]。然而,海參腸卵經(jīng)酶解后會產(chǎn)生一些醛類、醇類、酮類和烴類物質(zhì),使水解液具有較重腥味,難以加工利用[8-10],因此脫除腥味是實現(xiàn)海參腸卵酶解液高值化利用及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的技術(shù)關(guān)鍵。

近年來國內(nèi)外對脫腥的研究有很多,主要脫腥方法有物理法(水洗、吸附、微膠囊脫腥、包埋、輻照、掩蓋)、化學(xué)法(酸堿鹽脫腥、抗氧化劑脫腥、有機溶劑萃取、臭氧法)、生物法(酵母發(fā)酵脫腥)和復(fù)合法等[11-12]。物理法中水洗法易破壞樣品中水溶性成分;掩蓋法工藝簡單、易于推廣;吸附法是最常用的方法。王小康等[13]研究證明活性炭法和減壓蒸餾法均能脫除魚皮膠原蛋白中的一些腥味,且活性炭脫除效果更好。ESHTIAGHI等[14]研究了活性炭對初榨椰子油的脫腥效果,結(jié)果表明脫腥效果較好,且成分基本保持不變。而生物發(fā)酵法與化學(xué)法相比,安全系數(shù)高,無化學(xué)物質(zhì)殘留,消費者更容易接受,還能產(chǎn)生特殊的風(fēng)味。王曉君等[15]采用酸法、堿法和酵母法對兔腿肉進行了脫腥處理,得出酵母脫腥法效果最好的結(jié)論。

本研究選用生姜掩蓋法、活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、酵母發(fā)酵法和乳酸菌發(fā)酵脫腥法5種方法對海參腸卵酶解液進行脫腥處理,利用電子鼻、電子舌和頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace-solid phase micro-extraction/GC-MS,HS-SPME/GC-MS)結(jié)合感官評定分析,比較不同脫腥方法的脫腥效果。以期為海參腸卵資源的綜合利用和深加工提供現(xiàn)實指導(dǎo)和理論依據(jù),推動海參加工副產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參腸卵,蓬萊深奧生物科技研究所；酵母菌,安琪酵母股份有限公司；乳酸菌,山東中科嘉億股份有限公司；木瓜蛋白酶(80萬 U/g),南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；中性蛋白酶(15萬 U/g),山東隆科特酶制劑有限公司；生姜,市售；活性炭,天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；大孔樹脂AB-8,天津波鴻樹脂科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；恒溫搖床培養(yǎng)箱,上海天呈實驗儀器制造公司；電子舌,法國Alpha MOS公司；電子鼻,德國AIRSENSE公司；QP-2020氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Rtx-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),日本SHIMADZU公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參照趙彥珺[16]的方法。取適量冷凍海參腸卵,用攪拌機打碎,1∶9料水比拌勻,中性蛋白酶加酶量為1 500 U/g(底物),木瓜蛋白酶加酶量為16 000 U/g(底物),55 ℃下酶解2 h,過濾取上清液,95～100 ℃滅酶10 min,得海參腸卵酶解液,冷藏備用。

1.3.2 酶解液水解度(degree of hydrolysis,DH)的測定

DH是指蛋白質(zhì)在水解過程中被斷裂的肽鍵數(shù)占其總肽鍵數(shù)的百分比。DH計算如公式(1)所示：

(1)

式中：總氮含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定 凱氏定氮法》；氨基酸態(tài)氮含量的測定參考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定 酸度計法》。

1.3.3 生姜掩蓋法脫腥

生姜去皮后,取適量攪碎,按照質(zhì)量分數(shù)1%、2%、3%、4%、5%的添加量將生姜末加入酶解液中,混合后超聲浸提1 h,過濾,冷藏備用。

1.3.4 吸附法脫腥

大孔樹脂吸附法[4]：將大孔樹脂用去離子水洗至無味,無細小樹脂及其他雜質(zhì)。用無水乙醇浸泡24 h,用去離子水反復(fù)清洗至無味。質(zhì)量分數(shù)5% HCl溶液浸泡4 h,排去酸液,用去離子水洗至中性,以質(zhì)量分數(shù)4% NaOH浸泡4 h,排去堿液,去離子水洗至中性。濕基保存,使用時干燥脫水。按照質(zhì)量分數(shù)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的添加量將大孔樹脂加入酶解液中,混合后的樣品置于轉(zhuǎn)速150 r/min、30 ℃的恒溫搖床中振蕩1 h,過濾,冷藏備用。

活性炭吸附法[17]：按照質(zhì)量分數(shù)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的添加量將活性炭加入酶解液中,混合后置于轉(zhuǎn)速150 r/min、40 ℃的恒溫搖床中振蕩1 h,過濾,冷藏備用。

1.3.5 生物發(fā)酵法脫腥

取2份海參腸卵酶解液,加入3%(質(zhì)量分數(shù))的葡萄糖,冷卻至40 ℃,分別加入質(zhì)量分數(shù)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的乳酸菌和酵母菌,40 ℃下發(fā)酵10 h[18],滅菌后冷藏備用。

1.3.6 感官評定

感官評定是判斷食物能否吸引消費者,制得理想風(fēng)味食品的重要方法。感官評定小組由10名具有豐富感官評定經(jīng)驗的成員組成,按照表1的腥味評價標準對6組樣品進行感官評定。以酶解液的腥味作為參比,分值為5。腥味越重,分值越高。成員可根據(jù)實際情況保留1位小數(shù),打分后取平均值,進行數(shù)據(jù)分析。

表1 樣品腥味的感官評定標準

1.3.7 電子舌、電子鼻分析

準確移取25 mL待測液加入電子舌樣品杯中,測量前對電子舌進行自檢、活化、校準和診斷等步驟,以確保采集數(shù)據(jù)的可靠性和穩(wěn)定性。用30 mmol/L KCl溶液與0.3 mmol/L酒石酸溶液配成Ref Sol參比溶液,將傳感器置于參比溶液中歸零30 s,隨后開始測定。測試時間為30 s,測試完畢后用參比溶液清洗3 s,再次進行回味測定,測試時間30 s。每個樣品重復(fù)4次,取后3次作為測試結(jié)果。

準確移取15 mL樣品置于25 mL電子鼻頂空瓶中,加蓋密封,26 ℃下靜置30 min后檢測。測定參數(shù)：清洗時間120 s,歸零時間5 s,預(yù)進樣時間8 s,測定時間60 s,載氣流速400 mL/min,每個樣品測定3次。

1.3.8 HS-SPME/GC-MS

取5 mL樣品于20 mL棕色頂空瓶內(nèi),65 ℃恒溫水浴10 min,隨后將65 μm PDMS/DVB萃取頭插入棕色頂空瓶中繼續(xù)水浴萃取30 min,萃取完成后立刻進入GC-MS進行檢測,每組樣品平行測定2次。

氣相色譜條件：Rtx-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度250 ℃,不分流模式進樣,載氣為He,流速為1.0 mL/min；程序升溫：初溫40 ℃,保持2 min,隨后以4 ℃/min升至160 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源采用電子電離(electron ionization,EI),GC-MS接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,檢測器電壓相對于調(diào)諧結(jié)果,質(zhì)量掃描范圍為m/z30～550[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

主成分分析(principal component analysis,PCA)繪圖采用Origin處理,其余數(shù)據(jù)用Excel進行數(shù)據(jù)處理,用SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液DH

經(jīng)測定,酶解液中總氮含量為0.66 g/100 g,氨基酸態(tài)氮含量為0.24 g/100 g,計算得出DH為36.36%,反應(yīng)體系中的底物基本被完全酶解,水解程度較充分。

2.2 感官評定結(jié)果分析

如表2所示,生姜掩蓋法總體腥味值較高,5%生姜添加量掩蓋腥味的效果最好,但生姜氣味較濃,對不喜生姜味道的消費者來說難以接受,存在局限性。大孔樹脂吸附脫腥效果不佳,樣品中的不良風(fēng)味僅輕微降低,添加量為2%時腥味值較低,且大孔樹脂原料預(yù)處理較麻煩,需進行長時間浸泡和反復(fù)清洗,若處理不當(dāng)會引入大孔樹脂的刺鼻氣味。活性炭脫腥效果一般,添加量為2.5%時腥味較低,且有研究表明,活性炭在吸附腥味物質(zhì)的同時,也吸附了其他風(fēng)味成分和營養(yǎng)成分,會降低總體風(fēng)味和營養(yǎng)價值[20],存在蛋白質(zhì)回收率偏低的問題[21]。經(jīng)酵母發(fā)酵處理后腥味較淡,但發(fā)酵不易控制,容易發(fā)酵過度,添加量為0.3%時腥味值最低,添加量過多會引入酵母味道,產(chǎn)生菌體不良風(fēng)味,對產(chǎn)品風(fēng)味帶來負面影響。乳酸菌發(fā)酵法處理的樣品腥味值較低,添加量為0.40%時感官評定結(jié)果較好。

表2 感官評價結(jié)果

2.3 電子舌檢測結(jié)果分析

為了快速、直觀地分析電子舌對不同樣品的響應(yīng)差異,采用PCA對電子舌數(shù)據(jù)進行總覽。PCA是將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個互不相關(guān)的綜合變量的分析方法[22]。圖1為6組樣品的電子舌響應(yīng)PCA得分圖(PC1=67.58%,PC2=18.20%),主成分代表了樣本中85.78%的信息,樣品信息損失率<15%,表明PCA模型可以綜合反映出電子舌數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示,經(jīng)不同方法處理后的樣品整體風(fēng)味輪廓差異顯著,無重疊,區(qū)分效果好。生姜和大孔樹脂處理與脫腥前樣品數(shù)據(jù)點較為接近,說明脫腥效果不大。活性炭處理后的樣品與脫腥前樣品的數(shù)據(jù)點差距較大,味道有一定差異。乳酸菌和酵母發(fā)酵脫腥后樣品與脫腥前差距最大,可能是受酵母菌和乳酸菌自身或其代謝產(chǎn)物的影響,使得脫腥前后味道差異顯著,這與感官評定結(jié)果基本一致。

圖1 不同方法處理樣品的電子舌檢測PCA圖

2.4 電子鼻檢測結(jié)果分析

電子鼻是一種可以獲取揮發(fā)性化合物整體輪廓的儀器,能夠避免人體自身嗅覺的缺陷,增強對氣味辨別的穩(wěn)定性和重復(fù)性[23]。表3中R1～R10分別是電子鼻不同傳感器檢測到的不同物質(zhì)種類。

表3 電子鼻傳感器代表種類

表4為電子鼻檢測數(shù)據(jù),數(shù)值大小代表傳感器對該類物質(zhì)的響應(yīng)強度。數(shù)值越小,說明響應(yīng)強度越弱,反之越強。生姜掩蔽法和酵母菌發(fā)酵法處理的樣品檢測到的氣味響應(yīng)數(shù)據(jù)均較脫腥前有所升高,可能是由于生姜和酵母菌本身及代謝產(chǎn)物的揮發(fā)性成分較高,使脫腥后樣品氣味更加豐富。酵母發(fā)酵脫腥后醇類物質(zhì)(W2S)的含量明顯高于其他方法,是因為酵母在發(fā)酵脫腥的過程中產(chǎn)生了小分子醇類物質(zhì),或原來的腥味大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了小分子醇類。大孔樹脂對部分氣味的響應(yīng)強度降低,部分升高。采用活性炭吸附法和乳酸菌發(fā)酵法處理后的樣品各項氣體檢測指標均有所降低,W2S傳感器測得的與腥味有關(guān)的醇類和醛酮類物質(zhì)有所降低。

表4 脫腥前酶解液與脫腥處理后樣品的電子鼻檢測數(shù)據(jù)

2.5 GC-MS檢測結(jié)果分析

如表5所示,通過HS-SPME-GC-MS技術(shù),海參腸卵酶解液中共檢測出37種揮發(fā)性成分,經(jīng)生姜掩蓋處理后揮發(fā)性成分有28種,經(jīng)活性炭吸附后揮發(fā)性成分有21種,大孔樹脂吸附后檢出22種,酵母發(fā)酵法共檢出25種,乳酸菌發(fā)酵法檢出20種。

表5 樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類及個數(shù)

海參腸卵酶解液中的主要揮發(fā)性成分有醛類、酮類、醇類、酯類、有機酸類、烴類、芳香類物質(zhì)等,腥味成分主要是庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、反,順-2,6-壬二烯醛、辛醇等醛醇類物質(zhì)(見附表)。脫腥前醛醇類物質(zhì)共有14種,生姜處理后為9種,大孔樹脂和活性炭處理后有6種,酵母處理后有9種,乳酸菌發(fā)酵后有2種。脫腥后揮發(fā)性腥味物質(zhì)均有所減少,其中乳酸菌發(fā)酵法效果最佳,這與感官評定、電子鼻和電子舌的檢測結(jié)果基本一致。

2.5.1 羰基化合物

羰基化合物主要包括醛類和酮類物質(zhì),醛類對水產(chǎn)品中的揮發(fā)性氣味有重要貢獻作用,尤其是一些相對分子質(zhì)量較低的醛類物質(zhì),閾值低,易產(chǎn)生刺激性氣味[11]。脫腥前,有多種醛類物質(zhì)被檢出,如壬醛、庚醛、辛醛、癸醛等呈強烈和不愉快脂肪氣味,具有刺激性腥味[24];壬二烯醛呈強烈油脂香氣,經(jīng)脫腥處理后,醛類物質(zhì)均明顯減少或被完全脫除。酮類物質(zhì)的閾值較高,但對腥味有增強作用[11],脫腥后酮類物質(zhì)的含量均顯著減少。

2.5.2 醇、酸類物質(zhì)

醇類包括飽和醇和不飽和醇。飽和醇的閾值一般比較高,對風(fēng)味貢獻不大。飽和醇中,C1～C3有輕快香味(如乙醇),C4～C6的醇類近似麻醉性的氣味,C7～C10則顯示出芳香氣味(如辛醇)。不飽和醇的氣味閾值低,氣味貢獻度較大,茨醇有似樟腦氣味,雪松醇具有溫和的杉木芳香。經(jīng)酵母發(fā)酵處理后,醇類物質(zhì)有所增加,原因可能是酵母在發(fā)酵脫腥的過程中產(chǎn)生了醇類物質(zhì)。發(fā)酵法脫腥的原理就是利用微生物的新陳代謝和微生物酶的作用,使腥味物質(zhì)被分解或修飾成沒有腥味的物質(zhì),如將醛、酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸,從而達到脫腥的目的[20]。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,酸類物質(zhì)含量有大幅度提升,乙酸等短鏈脂肪酸具有強烈的酸味和奶酪味且閾值較低,會使海參腸卵酶解液帶有特有的酸味和奶酪香味。

2.5.3 其他物質(zhì)

烯烴類化合物在一定條件下會形成醛和酮,對風(fēng)味有增強作用,是產(chǎn)生腥味的潛在因素[19],酵母發(fā)酵后產(chǎn)生了較多烯烴類物質(zhì),對風(fēng)味有一定負面影響,例如(角)鯊烯不穩(wěn)定,在空氣中易氧化,產(chǎn)生特殊臭氣。乳酸菌發(fā)酵法較其他方法處理后的烯烴類物質(zhì)含量最少。酯類物質(zhì)是由酸與醇通過酯化反應(yīng)生成的,易揮發(fā),有悅?cè)说奶鹣愫凸麑嵪阄丁Ｍ闊N類物質(zhì)的閾值較高,因此對整體的風(fēng)味貢獻不大[25]。另外,苯(異硫氰酸酯)具有刺激性臭味,經(jīng)脫腥后含量顯著減少。

3 結(jié)論

采用生姜掩蓋法、大孔樹脂吸附法、活性炭吸附法、酵母發(fā)酵法、乳酸菌發(fā)酵法對海參腸卵酶解液進行脫腥處理,以電子舌、電子鼻、GC-MS數(shù)據(jù)協(xié)同感官評定腥味值為評價依據(jù),綜合比較分析得出乳酸菌發(fā)酵法的脫腥效果較好。生姜掩蓋法對腥味有少許的遮蓋作用,但會使酶解液帶有較重生姜味。活性炭和大孔樹脂吸附法的脫腥效果不佳。酵母發(fā)酵法處理后的樣品酵母味和發(fā)酵后的酸味較重,對產(chǎn)品風(fēng)味帶來負面影響。乳酸菌發(fā)酵法與其他方法相比安全系數(shù)較高,更適用于海參腸卵酶解液的脫腥,可降低腥味成分,未引入不良風(fēng)味,蛋白損失少,無化學(xué)物質(zhì)殘留,是一種綠色有發(fā)展前景的脫腥方法,消費者更容易接受,在去除腥味物質(zhì)的同時還能產(chǎn)生悅?cè)孙L(fēng)味的酯類物質(zhì)等,具有一定的應(yīng)用潛力及價值。