六堡茶發酵前后多酚氧化酶的分離及酶學性質

龍峻瑤，黃 麗，夏 寧，滕建文，韋保耀，胡沛然

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530000）

六堡茶屬黑茶類，因其產于廣西蒼梧縣六堡鎮而得名，是擁有1 500多年歷史的名茶[1]。選用廣西大中葉種茶樹的鮮葉為原料，經過殺青、初揉、堆悶、復揉和干燥成為六堡茶毛茶，毛茶經過篩選、拼配、渥堆、汽蒸和陳化成為成品茶[2]，成品茶色澤黑褐而油潤，湯色紅濃且明亮，滋味醇厚回甘，有陳香味。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一類廣泛分布于植物、動物和真菌等細胞內的銅結合金屬蛋白酶[3]。氧氣可催化PPO發生2 種反應：單酚羥基化為o-雙酚和o-雙酚氧化為o-醌[4]。醌繼續氧化聚合成黑色素，導致組織褐變。與PPO導致果蔬中酶促褐變帶來的破壞作用相反，PPO是茶樹生理學與茶葉產品加工工藝學中極為重要的生物酶之一，對黑茶茶湯紅褐色的色澤、醇厚的口感和陳腐風味的形成十分重要[5]。

PPO對發酵茶品質的形成至關重要，但PPO在紅茶和黑茶中的來源并不相同。在紅茶加工過程中，茶葉被機械破壞后釋放出氧化還原酶，如PPO和過氧化物酶，它們能與兒茶素等酚類化合物相互作用形成茶黃素和茶紅素，通過測定PPO活性定量監測茶黃素和茶紅素，被用于紅茶品質、色澤和風味的評估[6]。在黑茶中，原料毛茶的PPO在粗加工過程中可能被滅活，渥堆過程中，PPO顯著增加[7]，豐富的微生物群生長繁殖分泌出新的PPO[8]，能將茶多酚轉化為茶黃素和茶紅素，進而轉化為茶褐素，茶湯苦澀感逐漸消失，紅褐色逐漸呈現，這與PPO存在著緊密聯系。目前，國外已有對茶樹PPO同工酶進行分離純化和酶學性質研究的報道[9-10]，然而，國內對茶樹PPO的研究還停留在粗酶的水平[11-12]，對黑茶PPO的研究也遠不足，僅柴潔等[7]報道了普洱茶固態發酵過程中PPO粗酶液酶學活性研究。六堡茶渥堆過程中PPO的來源及其酶學性質不得而知，所以本研究首先分離純化得到六堡茶毛茶和渥堆結束時期六堡茶的PPO，并進一步研究其同工酶的酶學特性，對黑茶PPO研究和黑茶加工控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自廣西梧州中茶茶葉有限公司702016批次的六堡茶毛茶和渥堆結束時期的茶葉樣品，在－20 ℃保存。

PVP30和PVP40 北京索萊寶科技有限公司；石英砂、對苯二酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、丙三醇、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍、甘氨酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍R-250 天津市達茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

XW-80A型旋渦混合器 上海醫大儀器廠；BLHH-6N型數顯恒溫水浴鍋 上海丙林電子科技有限公司；TL-18M高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技公司；SHZ-III型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；SB-5200型超聲波清洗機 上海新芝生物技術研究所；BSZ-100自動部分收集器、HD-A電腦層析采集儀、HL-2B數顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠；DYY-6C電泳儀、垂直電泳板 美國伯樂公司；85-2A型恒溫磁力攪拌器 常州博遠實驗分析儀器廠；UV-1601PC型紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制：制備0.1 mol/L檸檬酸母液和0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液各1 L，按一定體積比配制為所需pH值的緩沖液。

采用文獻[13]報道的方法提取PPO，并稍作修改。稱取六堡茶樣品1.25 g和聚乙烯吡咯烷酮0.75 g，加入pH 6.2的少量預冷磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在冰水浴下與5.0 g石英砂充分研磨，勻漿后定容至25 mL，4 ℃避光保存12 h，用4 層紗布過濾，4 ℃、8 500 r/min離心25 min，保存上清液。

1.3.2 PPO活力測定

取粗酶液0.2 mL，加入0.2 mL檸檬酸磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.6），1.2 mL混合反應液（0.1 mol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液-0.1%脯氨酸-1%鄰苯二酚，10∶2∶3，V/V），在37 ℃水浴30 min，加入1.2 mL 6 mol/L尿素終止反應。在460 nm波長處測定吸光度，對照組為不加鄰苯二酚的混合液。根據曲線斜率測定PPO活性，單位為U/（g·min）。

1.3.3 蛋白質含量的測定

采用Bradford[14]蛋白質染料結合法，以牛血清白蛋白為標準。將0.1 mL酶液、0.9 mL蒸餾水和5 mL染料混合，加6 mL蒸餾水，在595 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 PPO的純化

硫酸銨分級沉淀及透析：取8 mL粗酶液，加入無水(NH4)2SO4粉末，達到不同的飽和度。靜置2 h后，在4 ℃、9 000 r/min離心15 min。測定上清液中PPO活性和蛋白質濃度，確定最佳的鹽析方案。選擇合適的鹽析濃度后，將硫酸銨沉淀用pH 7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液復溶，在4 ℃、9 000 r/min離心15 min。將上清液在0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（分子質量截止值3 500 Da）中透析16 h，用聚乙二醇濃縮酶液，并于4 ℃保存。

凝膠過濾層析：層析柱（16 mm×800 mm）用初始緩沖液（按凝膠比緩沖液3∶1的比例）配成勻漿裝柱。酶液經0.2 μm濾膜過濾，然后用2～3 倍體積pH 7.2、0.2 mo1/L的磷酸緩沖液平衡柱子，將2 mL酶液上柱，用pH 7.2、0.2mol/L磷酸緩沖液進行洗脫（1 mL/min，8～10 mL/管），于波長280 nm處檢測酶活性峰，然后收集有活性峰的洗脫液。測定其酶活力及蛋白濃度。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

通過SDS-PAGE分析酶純度和分子質量。采用5%濃縮膠和12%分離膠，上樣量均為10 μL，電壓分別為60 V和120 V。電泳完畢，凝膠在0.1%考馬斯亮藍R-250溶液中使用搖床搖動2 h。凝膠變色，拍照保存。

1.3.6 PPO同工酶最適pH值和溫度

以鄰苯二酚為底物，用1.3.2節方法在pH 4.0～8.0范圍內測定PPO活性。用同樣的方法在20～60 ℃范圍內測定PPO的最大活性。在最適溫度下，PPO活性表現為相對PPO活性的殘余活性百分比。

1.3.7 PPO同工酶最適底物濃度

將底物鄰苯二酚分別配制成濃度為0、0.01、0.02、0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L的溶液，按照1.3.2節方法測定PPO活性。將最高酶活性記為100%，繪制相對酶活力圖。

1.3.8 PPO同工酶熱穩定性

將同工酶在70、80、90 ℃溫度條件下分別處理0～5 min，按照1.3.2節方法測定PPO活力。最高酶活力記為100%，繪制相對酶活力圖。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 粗酶液的提取

pH值對PPO的影響在于改變酶表面的電荷影響其溶解度以及破壞其結構。富含酚類的植物性原料中，PPO和酚類底物會不可逆結合影響酶的離子和疏水特性[15]，從而影響PPO的純化效果。在本研究中，PVPP、PVP K30、PVP40被用作抑制酚類化合物和PPO結合的保護劑，研究其最佳保護劑及用量。

如圖1A所示，PVP 40和PVP K30在pH 5.0～6.2范圍內的酶活力均高于pH 6.2～7.0范圍，并在pH 6.2時酶活力最大。其中PVP K30的最適pH 6.2，酶活力最高為157.0 U/（g·min）。如圖1B所示，PVP K30對PPO的提取效果最佳。當PVP K30為0.3 g時，粗酶液的最大酶活力為136.7 U/（g·min）。PVP 40和PVPP對PPO的保護作用不明顯。當PVP的加入量低時，PVP不能有效地吸附酚類物質，降低PPO活性。當PVP的添加量高時，PVP中的肽鏈結構可以在吸附酚類物質的同時與PPO中的Cu2＋螯合，從而影響PPO的活性。PVP含量過高，使提取物黏性過大，不利于PPO提取[16]。

如圖1C所示，以0.3 g PVP K30作為保護劑液料比在10∶1～20∶1范圍內酶活迅速增加，當液料比大于20∶1時，酶活增加緩慢。造成這種現象的原因可能是茶葉本身含水量極低，當液料比低時，磨茶困難，導致茶葉中的PPO不能在緩沖溶液中溶解，PPO活性低。當液料比增加時，PPO更多的溶于緩沖液中，酶活也隨之增加[17-18]。當液料比增加到一定程度時，酶活趨于穩定。考慮到原料本身和后期提純PPO，選擇20∶1作為提取PPO粗酶液的液料比。

圖1 保護劑對PPO活性的影響Fig. 1 Effect of protective agents on PPO activity from Liupao tea

2.2 PPO的分離純化

圖2 硫酸銨分級沉淀后上清液的蛋白含量及酶活力Fig. 2 Protein content and PPO activity of supernatant after fractional precipitation with (NH4)2SO4

經緩沖液提取的粗酶液含有大量雜質，包括雜蛋白及酚類物質，在這些物質的作用下，粗酶液的酶活會逐步降低，并發生褐變反應，使粗酶液顏色加深。硫酸銨分級沉淀法能利用不同蛋白在硫酸銨中溶解度不同的特性，去除粗酶液中的部分雜蛋白，濃縮目標蛋白，以提高分離效率。圖2顯示，在10%的(NH4)2SO4飽和度下，上清液中的PPO活力降低，出現蛋白質沉淀。在飽和度為70%時，酶活達到最小值。因此，選擇70%的(NH4)2SO4沉淀PPO。在飽和度10%～30%時，上清液殘余蛋白不斷減少，而在飽和度10%～40%時，上清液殘余酶活力變化不明顯，說明這期間沉淀了部分雜蛋白，所以選擇飽和度30%的(NH4)2SO4去除雜蛋白。之后進行Sephadex G-100凝膠過濾層析，測定洗脫液在波長280 nm處的吸光度和酶活力，得到發酵前后茶樣的PPO凝膠過濾層析的結果，如圖3所示。

圖3 發酵前后六堡茶蛋白質Sephadex G-100凝膠過濾層析圖譜Fig. 3 Sephadex G-100 gel filtration chromatogram of PPO from unfermented and fermented Liupao tea

由圖3可知，六堡茶毛茶和渥堆結束茶葉的洗脫過程中都出現2 個洗脫峰，分別在第10～13收集管和第25～30收集管中。第1個洗脫峰有PPO活性，第2個洗脫峰沒有PPO活性，第2個峰可能是小分子的雜蛋白，因此收集各自的洗脫峰1的洗脫液，濃縮后，進行SDS-PAGE。

2.3 SDS-PAGE結果

圖4 純化后PPO的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of purified PPO

將純化后的PPO進行SDS-PAGE，結果如圖4所示。六堡茶毛茶中有一條分子質量約為59 kDa（命名為PPO1）的條帶，發酵后的六堡茶除了具有相似的條帶外，還出現了一條顏色較淺的同工酶條帶，分子質量約為70 kDa（命名為PPO2）。茶樹中含有多個PPO同工酶，其分子質量大小與茶葉種類有關。Teng Jie等[19]從茶葉中分離出2 種分子質量分別為85 kDa和42 kDa的PPO同工酶。張書芹等[20]報道龍井茶中PPO同工酶亞基的大小分別為53 ku和80 ku左右。劉琨[21]從碧螺春獲得2 個同工酶，亞基大小分別為36 ku和42 ku。在本課題組前期研究中，比較了六堡茶和綠茶PPO的分子質量，發現綠茶中PPO分子質量在25～35 kDa之間，發酵2 d的六堡茶中PPO分子質量在48～63 kDa之間，發酵10 d的六堡茶中觀察到2 條同工酶譜帶，分別為48～63 kDa和63～75 kDa。在本研究中，PPO1的分子質量與綠茶接近，PPO1可能是茶樹PPO，而PPO2可能是微生物在六堡茶發酵過程中產生的一種微生物源PPO。鑒于真菌在發酵過程中對茶葉品質的變化起主要作用，且大多數真菌漆酶是分子質量在59～80 kDa之間[22]，故推測PPO2是真菌漆酶。Baldrian[23]報道了白腐菌漆酶的分子質量為69 kDa。Iyer等[24]從稻瘟病菌中純化漆酶，發現其分子質量為70 kDa，與PPO2的分子質量一致。

目前，已有相關黑茶或者植物堆肥中微生物產生PPO的報道。Mayende等[25]從堆肥中分離出能產生PPO的嗜熱微生物，該微生物為Bacillussp.。Li Zhongyuan等[26]使用宏基因組和代謝組學分析表明，普洱茶中茶多酚向茶褐素的轉化主要是由過氧化物酶和漆酶完成，而兒茶酚氧化酶更多存在于植物。對產生漆酶的微生物進行分析，主要是真菌如曲霉、德巴利酵母、酵母、Rasamsonia、橫梗霉、Depriyomyces和少部分的細菌如假單胞菌和葡萄球菌等。Wang Qiuping等[27]從普洱茶中分離到煙曲霉，利用其將茶多酚轉化為茶褐素。在本課題組的前期研究中，分離到產PPO的微生物并研究其酶量。Pantoea oleae、肺炎克雷伯氏菌和成團泛菌的產酶量均在20 U/mL以上，霉菌中的黑曲霉產量大于35 U/mL，煙曲霉大于40 U/mL，灰黃霉素大于25 U/mL，說明微生物產生的PPO對黑茶品質的轉化起關鍵作用。

2.4 pH值和溫度對PPO同工酶活性的影響

pH值可以改變氨基酸鏈或底物的電離狀態，從而影響酶的活性[28]。在過酸過堿環境中，酶活性部位的質子異變基團的電離變化能破壞活性位點的最適環境，影響酶與底物的結合以及催化反應。此外，pH值所引起的蛋白質不可逆變性也能影響酶的催化活性。

圖5 pH值（A）和溫度（B）對同工酶PPO1和PPO2酶活力的影響Fig. 5 Effects of pH (A) and temperature (B) on the activities of PPO1 and PPO2

如圖5A所示，PPO1和PPO2的活性在pH 4.0～8.0范圍內先增大后減小，PPO1在pH 6.5時有最佳活性，PPO2在pH 6.0時有最佳活性，說明微生物產生PPO的最佳pH值小于茶葉本身PPO。該結果與已經報道的茶葉和果蔬中的研究結果接近。Altunkaya[29]報道茶葉PPO最佳pH 6.0，普洱茶發酵粗酶液中PPO最適pH 5.5[7]。Saki等[30]報道了野生食用菌中PPO最適pH 7.0，Han Qianyun等[31]從蘋果中提取PPO最適pH 7.0。Iyer等[24]報道了漆酶的最適pH 6.0。六堡茶毛茶的pH值接近中性，當渥堆開始時，pH值隨著發酵時間的延長會降低，使茶葉呈現弱酸性，更利于微生物PPO的釋放，促進六堡茶特有品質形成。

六堡茶在渥堆過程中，為了防止溫度過高導致燒堆變質，會定期翻堆散熱使中心溫度控制在50 ℃左右，故研究溫度范圍在20～60 ℃時對PPO1和PPO2活性的影響。如圖5B所示，六堡茶PPO活性隨溫度升高而升高，達到最適溫度后活性下降，PPO1的最適溫度為40 ℃，PPO2的最適溫度為35 ℃。目前，有研究報道了綠茶PPO在10～70 ℃最佳溫度為30 ℃[6]，這與本結果PPO1的酶活力存在略微差異，主要由于六堡茶毛茶與綠茶不同，它是經過輕微發酵的茶。Allan等[32]從茄子中提取的PPO最適溫度為40 ℃，Kumar等[33]報道黃曲霉在35 ℃時PPO產量最高，也說明微生物產生的PPO2在35 ℃時有較高酶活，與本研究結果相似。六堡茶在毛茶時期產生的PPO主要來自于茶葉自身，能耐受較高溫度，發酵結束后，茶堆中心溫度下降，微生物源PPO2的耐熱性較低。

2.5 底物濃度對PPO同工酶活性的影響

圖6 鄰苯二酚濃度對PPO活力的影響Fig. 6 Effect of catechol concentration on PPO activity

如圖6所示，鄰苯二酚濃度在0～0.5 mol/L范圍內，酶活力增加，當濃度達到0.5 mol/L時，PPO1和PPO2有最佳酶活力，當濃度高于0.5 mol/L時，酶活力開始下降，原因是PPO與鄰苯二酚結合達到飽和從而產生抑制效果。這與謝微等[34]報道芋頭中的最適底物濃度（鄰苯二酚）為0.4 mol/L相似。

2.6 PPO同工酶熱穩定性分析

圖7 同工酶PPO1和PPO2的熱穩定性曲線Fig. 7 Thermal stability curves of PPO1 and PPO2

如圖7所示，PPO1在70 ℃和80 ℃經熱處理一定時間后，酶活力下降，反應結束后的相對酶活力分別為59%和23%，在90 ℃時，PPO1幾乎完全失活。PPO2在70 ℃處理5 min的相對酶活力降低至28%，在80 ℃和90 ℃處理5 min，幾乎完全失活。說明微生物源PPO2的耐熱性低于茶源PPO1。在六堡茶渥堆結束時，將進入汽蒸階段，可將溫度控制在90 ℃處理5 min，能使茶葉PPO滅活，為六堡茶加工提供理論基礎。Chutintrasri等[35]表明菠蘿PPO在70 ℃和80 ℃分別處理5 min時，酶活力分別下降至59%和31%，在90 ℃時，酶活力為1.2%。Li Ran等[36]測定了在75～95 ℃水燙過程中殘留的菊苣葉PPO活性，表明在75 ℃處理5 min的相對酶活力為45%左右；80 ℃處理5 min的相對酶活力為32%；在90 ℃處理5 min的PPO幾乎滅活。這些數據與本研究中獲得的PPO1結果基本一致，表明植物源PPO的熱穩定性相近，而微生物源的PPO2活性明顯低于植物PPO。

3 結 論

本研究從六堡茶中分離得到2 種PPO同工酶，其中PPO1是茶樹本身的PPO，PPO2是發酵過程中微生物產生的PPO，說明六堡茶在渥堆過程中是由2 種不同來源的PPO共同促進其品質形成。研究2 種同工酶的理化性質，表明微生物源PPO2的最適pH值、最適溫度和熱穩定性都低于茶樹PPO1，這些數據有利于黑茶加工控制，為黑茶PPO的研究提供一定理論基礎。但黑茶的茶樹PPO和微生物源PPO對茶葉的作用機制還需要深入研究。