基于GC-IMS結合多元統計方法分析炸制時間對花椒調味油揮發性物質的影響

倪瑞潔，詹 萍,*，田洪磊,2,*

（1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是蕓香科花椒屬植物，具有獨特的香味和麻味，能夠去腥、提香、增味、開胃，是“八大調味品”之一[1-2]。花椒油是花椒在烹飪中的傳統應用形式之一，油炸后的花椒油比普通花椒油的風味透發性更強，更符合大眾的口味。然而在油炸過程中，過長的油炸時間或過高的油炸溫度會發生一系列復雜的反應，產生不良風味[3-4]，因此選擇適當的炸制條件制備花椒調味油尤為重要。

目前，國內外針對花椒油的研究主要集中在花椒揮發油及浸提花椒油，關于花椒調味油的風味研究較少。Liu Yuping等[5]采用超臨界二氧化碳萃取法制得花椒揮發油，用氣相色譜-質譜聯用嗅覺儀（gas chromatographymass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）分離鑒定出32 種氣味活性化合物。牛文婧等[6]采用頂空-固相微萃取-GC-MS測定出7 個不同品種花椒油中的81 種香氣物質。陳海濤等[7]采用香氣稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法結合GC-MS-O分析發現芳樟醇、大根香葉烯D、檸檬烯、乙酸芳樟酯、乙酸-4-松油烯醇酯等是炸花椒油中的關鍵香氣化合物。Sun Jie等[8]采用AEDA和GC-MS-O分析比較韓城花椒油和韓源花椒油的香氣特征，發現β-水芹烯、對傘花烴、乙酸辛酯、辛醛、香茅醇和檜烯是引起差異的主要原因。上述研究在分離鑒定化合物時主要采用GC-MS，該技術靈敏度高、分離性能強、重復性好，是一種成熟的常規分析技術，但此技術無法分析鑒定出一些含量少而對風味至關重要的物質，且預處理步驟和質譜分析時間限制其應用[9-10]。

氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年來出現的一種新型氣相分離檢測技術，該技術結合GC的高分離能力和IMS的快速響應，具有響應快、靈敏度高、穩定性好等特點[11-12]。到目前為止，這項技術已經應用在食品分類和摻假[13-14]、異味檢測[15]、加工過程的監控[16]以及貯存過程中香氣變化的評估[17]等方面，而將GC-IMS用于花椒調味油揮發性化合物的分析研究鮮見報道。

本研究以花椒調味油為研究對象，采用電子鼻和GCIMS對不同炸制時間制得的花椒調味油進行揮發性成分及指紋圖譜分析，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、判別因子分析（linear discriminant analysis，LDA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），解析花椒調味油樣品間揮發性組分差異，并篩選標志性化合物，以期對花椒調味油的風味組成進行探究，為花椒調味油的風味品質調控技術創制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大紅袍花椒，產自陜西韓城（35°48′N，110°43′E），采購于當地農戶；魯花低芥酸特香菜籽油市購。

1.2 儀器與設備

iNose電子鼻 上海瑞玢國際貿易有限公司；Flavour Spec?GC-IMS聯用儀 德國G.A.S公司；SE202F百分之一天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將花椒進行除雜篩選處理，準確稱取150 g菜籽油倒入0.5 L圓底燒瓶中，在油浴中逐漸加熱至130 ℃時控溫，加入25 g干花椒顆粒進行恒溫炸制，且炸制過程中不斷攪拌混合物以防止局部過熱。整個過程使用油溫計測量溫度，分別持續5、15、25 min和35 min后停止加熱，自然冷卻至室溫，并去除花椒顆粒，單獨盛取花椒調味油，冷藏待用。對制得的花椒調味油依次編號，分別為HPO1、HPO2、HPO3和HPO4。

1.3.2 感官評價

參考Sun Jie等[8]研究并調整：準確稱取10 g花椒調味油于無嗅的透明PET瓶中（體積50 mL），在室溫下由感官評價小組進行描述性感官評價分析（descriptive sensory analysis，DSA）。經3 輪培訓和篩選后，感官評價小組由10 名成員（5 男，5 女，20～30 歲）組成。在培訓期間，小組成員討論并確定了樣品的呈香屬性及相對應的標準氣味劑。呈香屬性分別為草藥味、檸檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味。將這些呈香屬性與下列標準氣味劑水溶液進行比較：草藥味（1,8-桉樹腦）、檸檬香（檸檬烯）、青香（芳樟醇）、松木香（β-月桂烯）和脂肪香（(E)-2-庚醛），焦糊味呈現出令人不愉快的味道。各呈香屬性以1為增量，在0（無臭味）～9 （極強氣味）范圍內進行評估。樣品之間間隔1 min，所有樣品進行3 次評估，結果取平均值。

1.3.3 電子鼻分析

電子鼻利用非特異的、靈敏的傳感器陣列和模式識別系統，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等多元統計分析，反映樣品的整體氣味信息，能較好區分食品的品質差異[18-20]。分別準確稱取7 g 花椒調味油于40 mL頂空瓶中密封，室溫下平衡30 min。在分析樣品之前，必須開機預熱1 h，清洗儀器30 min，以純空氣作為載氣清洗傳感器陣列，使響應信號降為0。進樣體積為1 000 μL，分析采樣時間為120 s，樣品之間清洗180 s。以上步驟均在室溫下進行，每個樣品測定5 次平行。

1.3.4 GC-IMS分析

頂空進樣條件：準確稱取1 g花椒調味油，裝入20 mL頂空進樣瓶中密封。50 ℃條件下孵育20 min，孵化轉速500 r/min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積500 μL。

GC條件：FS-SE-54-CB-1非極性色譜柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；柱溫60 ℃；分析時間30 min；載氣：N2（純度≥99.999%）；載氣流速：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～10 mL/min；10～20 min，10～100 mL/min；20～30 min，100～150 mL/min。

IMS條件：漂移管長度5 cm；管內線性電壓400 V/cm；漂移氣：N2（純度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS溫度45 ℃。

1.4 數據處理

電子鼻數據利用內置的smartNose分析軟件進行線性判別分析；利用GC-IMS一系列配套的分析軟件（LAV（laboratory analytical viewer），Reporter插件、Gallery Plot插件和Dynamic PCA插件以及GC×IMS Library Search）對花椒調味油的揮發性香氣物質進行數據采集和分析。采用IBM SPSS Statistics 25.0進行單因素方差分析（ANOVA），利用Duncan多重比較評定樣品間的差異性，P≤0.05，認為數據具有統計學意義。采用Origin 2018對數據進行統計分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 花椒調味油感官評價分析

通過DSA對4 個樣品（HPOs）的草藥味、檸檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味6 個呈香屬性進行評價和比較，結果如圖1所示。HPOs樣品具有不同的香氣強度，其中草藥味、檸檬香、松木香和焦糊味存在高度顯著差異（P＜0.001）。HPO1表現出最弱的草藥味、檸檬香、松木香和焦糊味以及最強的脂肪香，可能是由于炸制時間較短（5 min）。隨著炸制時間的延長，所有樣品（HPO2～HPO4）的草藥味、檸檬香、松木香均出現不同程度地增強，脂肪香逐漸減弱。而焦糊味在HPO4中最強烈，但在其他HPO樣品中較弱，這表明當炸制時間超過35 min時，焦糊味會增強。同時HPO2是在中等炸制時間（15 min）下制備的樣品，表現出最強的草藥味、檸檬香和松木香，脂肪香和青香適中，有很弱的焦糊味，使HPO2的整體香味濃郁，清香獨特，油膩感弱，最容易被小組成員接受。

2.2 花椒調味油電子鼻分析

為避免生理嗅覺的缺陷，增強對食品氣味辨別的穩定性和重復性，采用電子鼻系統獲取揮發性化合物整體輪廓，根據14 根傳感器對樣品的平均響應值建立雷達指紋圖譜和傳感器信號強度圖[21]，比較4 個花椒調味油樣品之間的差異。如圖2a所示，花椒調味油風味差異主要集中在傳感器0、1、7、11和12上，表明電子鼻對不同炸制時間的花椒調味油風味區分效果較好，尤其是在傳感器7上，對花椒調味油的風味輪廓感知更敏感，區分效果最佳。

圖2 電子鼻檢測不同炸制時間的花椒調味油的風味雷達圖（a）和LDA圖（b）Fig. 2 Radar map (a) and LDA (b) plot of E-nose data of fried pepper oils with different frying times

LDA可用于確定HPOs之間存在可察覺的嗅覺差異，縮小同類數據的差異，擴大不同數據之間的差異，組間距離越大說明差異性越大[22]。如圖2b可知，樣品聚集明顯，花椒調味油能很好地被區分。HPO1和HPO2主要集中在圖上方，HPO3和HPO4主要集中在圖下方。此外，圖中各HPO的3 個平行之間的重復性也較好，無顯著差異。根據LDA結果，在不同炸制時間下，HPOs的香氣強度存在顯著差異，可以用電子鼻有效識別，這些結果與DSA獲得的結果一致。

2.3 花椒調味油的GC-IMS分析

2.3.1 不同炸制時間花椒調味油中揮發性化合物GCIMS分析

由Reporter插件生成不同炸制時間下花椒調味油中揮發性化合物的GC-IMS三維譜圖。如圖3a所示，不同炸制時間花椒調味油中的揮發性化合物種類相似，但峰值強度有所不同。隨著炸制時間的延長，幾乎沒有新的化合物生成，僅出現含量的變化。

為進一步直觀比較樣品之間的差異，結合二維俯視圖對樣品的GC-IMS進行分析，如圖3b所示。背景為藍色，橫坐標1.0處紅色豎線為反應離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP峰兩側的每一個點代表一種揮發性有機物。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。化合物主要集中在不同炸制時間之間A、B區域相比較，A區域中部分化合物顏色加深，B區域的化合物顏色變淺，說明隨著炸制時間的延長，A區域的化合物含量增加，B區域的化合物含量降低。

圖3 不同炸制時間花椒調味油中揮發性有機物的GC-IMS三維譜圖（a）和二維譜圖（b）Fig. 3 GC-IMS 3D (a) and 2D (b) topographic images of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.2 不同炸制時間花椒調味油中揮發性化合物定性分析

采用GC×IMS Library Search中內置的NIST數據庫和IMS數據庫，根據保留指數、保留時間和離子遷移時間對花椒調味油中揮發性化合物進行定性分析，結果如表1所示。部分揮發性化合物出現了二聚體甚至多聚體，它們具有相近的保留時間和不同的遷移時間，這是GC-MS聯用儀所檢測不出的[23]。在4 個樣品中共鑒定出46 種揮發性化合物，包括醛類19 種、萜烯類15 種、醇類8 種、酯類3 種和酮類1 種。隨著炸制時間的延長，揮發性有機物的種類沒有發生變化，醇類、酯類含量均出現不同程度的先下降后上升趨勢，萜烯類化合物含量變化不大。醛類化合物包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等，這些化合物主要是脂質氧化的產物，與脂肪和油性風味有關，為花椒調味油的脂肪香提供較大的貢獻；萜烯類化合物含量最高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-松油烯、β-羅勒烯等，賦予花椒調味油濃烈的青香、木香和薄荷香，是花椒調味油的主要呈香物質[8]；醇類化合物包括α-松油醇、芳樟醇、桉葉油醇等，主要賦予花椒調味油薄荷香、藥草香和花香[7]；酯類和酮類化合物主要提供了果香，這些化合物共同構成了花椒調味油濃厚綿長的獨特風味。

表1 不同炸制時間花椒調味油中的揮發性化合物Table 1 Volatile compounds in fried pepper oils with frying times identified by GC-IMS

續表1

2.3.3 不同炸制時間花椒調味油中揮發性化合物指紋圖譜

采用儀器配套的Gallery Plot插件生成指紋圖譜，可直觀地呈現不同炸制時間花椒調味油之間的揮發性化合物差異。如圖4a所示，同一行表示同一花椒調味油中的揮發性化合物的信號峰，同一列表示同一揮發性化合物在不同花椒調味油中的信號峰，整個指紋圖譜可以呈現每種樣品的完整揮發性有機物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異。顏色由淺到深表示揮發性化合物的含量由低到高。不同炸制時間的花椒調味油之間差異顯著。紅框中的物質隨花椒炸制時間的延長含量呈上升趨勢，包括(E)-2-庚醛、(E)-2-戊醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、乙酸異戊酯和乙醇等，多數為醛類。綠框中的物質隨花椒調味油炸制時間延長含量呈先上升后下降趨勢，包括α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙縮醛等。部分揮發性化合物在花椒調味油的4 個樣品中含量均很高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、β-羅勒烯、檸檬烯、芳樟醇、2-甲基丁醛等，與陳海濤等[7]的研究結果一致。檸檬烯與芳樟醇含量在一定程度上反映了花椒的品質和差異，對花椒調味油的風味也有一定的影響[24]。

利用LAV軟件對4 個HPOs進行PCA。如圖4b所示，根據PCA結果，2 個PC的貢獻率（PC1為73%；PC2為8%）占方差的81%，能反映出樣品的總體特征[25]。隨著炸制時間的延長，代表花椒調味油的點在PCA圖上呈現從左到右的規律排列。顯然，每個樣本都可以區別于其他樣本，并且在得分圖的不同區域有明顯的聚類。HPO1和HPO2集中在圖右側，而HPO3和HPO4主要位于圖左側。花椒調味油（HPO1～HPO4）之間的差異主要集中在PC1。

圖4 不同炸制時間花椒調味油中揮發性有機物的指紋圖譜（a）及PCA圖（b）Fig. 4 Fingerprint (a) and PCA plot (B) of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.4 不同炸制時間花椒調味油中揮發性化合物PLS-DA

PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的有監督的分析方法，能夠對數據進行降維，實現復雜數據的可視化及判別分析和預測[26-27]。在PLS-DA中使用7 倍交叉驗證預測殘差方差分析和100 次隨機重分類的響應置換評價模型的性能指標。交叉驗證用于確定解釋X方差、Y方差和交叉驗證預測能力（Q2）的總數量所代表的足夠PCs的數量[25]。其中，代表該模型較可靠。如圖5a所示，所有的R2值和Q2值均是模擬值低于原始值，Q2的回歸線截距為負值，上述結果說明該模型穩定性較好，未出現過擬合現象，具有較好的預測能力。

PLS-DA因子載荷圖可直觀地反映每一個變量在得分圖上的貢獻[28]，對不同炸制時間制得的花椒調味油中重要香氣成分進行分析。如圖5b所示，20（β-蒎烯）、36（萜品四醇）、32（α-蒎烯）、10（糠醛）、17（2-甲基丁醛）、42（1-丙醇）等物質是HPO1的特征性風味物質；24（檸檬烯）、28（α-水芹烯）、13（乙縮醛）、26（α-松油烯）、45（3-甲基丁酸乙酯）等物質是HPO2的特征香氣物質，萜烯類物質多，檸檬香和松木香濃烈；HPO3的主要香氣成分有19（2-丙烯醛）、38（1,8桉樹腦）、34（α-蒎烯）、25（檸檬烯）、37（芳樟醇）等風味物質；HPO4的香氣成分主要是醛類物質，包括1（己醛）、3（(E)-2-戊醛）、4（庚醛）、14（戊醛）、22（β-蒎烯）、44（3-甲基丁酸乙酯）等物質，由于炸制時間過長，脂肪氧化程度高，導致焦糊味明顯增強，與DSA和指紋圖譜結果一致。

變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可用于篩選對花椒調味油呈香輪廓有重要影響的關鍵標記物[29]。如圖5c所示，20 種VIP值大于1的揮發性化合物在判別中具有重要作用，分別為芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇和3-甲基丁酸乙酯，VIP值越大，差異越顯著。在以上化合物中，有11 種醛類化合物和6 種萜烯類化合物，因此醛類和萜烯類對于花椒調味油整體風味的影響尤為關鍵。醛類化合物主要是由多不飽和三酰甘油熱氧化產生[30-31]，氧化產物隨炸制時間的延長而增多，如正己醛是亞油酸的關鍵氧化代謝產物，亞麻酸等不飽和脂肪酸在一定條件下可快速降解為2-己烯醛，并轉化為正己醛[32]。單萜（β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯）和含單萜的含氧化合物（芳樟醇）可能是在花椒內合成的，在炸制的過程中從花椒中浸出到油中。在生物合成中，首先生成主前體焦磷酸異戊烯酯（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP被異構化為二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），然后IPP和DMAPP單元縮合得到異戊烯基化的焦磷酸酯，這是不同萜類化合物的直接前體。IPP和DMAPP單元之間的縮合反應是由特定的戊烯基轉移酶催化的[33-34]。如果縮合產物為香葉基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），GPP在單萜合成酶作用下可轉化為芳樟醇、檸檬烯和1,8-桉樹醇；如果產物為二磷酸神經磷酸酯（neryl diphosphate，NPP），則NPP在單萜合成酶作用下轉化為α-萜烯和水芹烯[35]。結合醛類和萜烯類化合物在炸制過程中的含量變化，選擇炸制時間為15 min，與DSA結果一致。

圖5 不同炸制時間花椒調味油中揮發性有機物的PLS-DAFig. 5 PLS-DA of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

3 結 論

本研究采用描述性感官分析、電子鼻和GC-IMS對不同炸制時間下花椒調味油的香氣特征進行分析。結果表明在炸制15 min時，HPO2表現出最強的草藥味、檸檬香和松木香，且焦糊味很弱，使HPO2的整體香味濃郁，清香獨特，油膩感弱。在花椒調味油中共分離鑒定出46 種化合物，包括醛類19 種、萜烯類15 種、醇類8 種、酯類3 種和酮類化合物1 種。隨著炸制時間的延長，4 個花椒調味油中的揮發性化合物種類相似，但峰值強度存在顯著差異，其中醛類物質包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等的含量呈現上升的趨勢，α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙縮醛等的含量呈先上升后下降趨勢，醇類、酯類含量隨著炸制時間的延長先下降后上升，萜烯類化合物含量變化不大。通過PLS-DA共篩選出20 種標志性化合物，包括芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇、3-甲基丁酸乙酯等。