原子力顯微鏡分析激光消融對牙本質表面微納米結構的影響

林琪 林昱 謝云德 馬忠雄

福建醫科大學附屬口腔醫院口腔黏膜科，福建省口腔疾病重點實驗室，福州350002

直接或間接修復體的粘接強度影響修復的遠期效果，釉質的粘接通過酸蝕等途徑較易獲得令人滿意的粘接強度，但牙本質的粘接效果較差，提升牙本質粘接強度是口腔臨床工作面臨的重要挑戰。

近年來，餌激光家族中新型的摻鉺鉻釔鋁石榴石激光（Erbium，Chromium:Yttrium-Scandium-Gallium-Garnet，Er，Cr:YSGG，λ=2.78μm）憑借其安全、快速、精確等顯著的牙體硬組織作用優勢成為研究熱點[1]。文獻[2-3]報道，激光輻照時，其波長能夠被牙體組織中水、羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）和膠原纖維吸收而產生消融作用，表層牙體硬組織及其中的水分被迅速加熱，其中的水被瞬間蒸發，水蒸氣在輻照區域導致局部內膨脹，當膨脹力量超過牙體結構的晶體結合力時，牙體結構發生消融破壞[4]。當選用較短脈寬鉺激光并伴隨噴水冷卻情況下輻照硬組織時，輻照區域產生的熱量很少傳播到鄰近正常牙體組織，但隨著激光能量的增高，激光光能引起輻照區域溫度升高使組織內壓力增大，在提高硬組織消融效率的同時還會影響輻照區域組織發生局部物理、化學性能改變；更高劑量下進行激光輻照，可能引起組織熔融改變。但激光熱機械消融的過程對牙本質表面理化性質造成的影響仍缺乏研究，激光輻照可能引起組織熔融改變，影響組織表面形貌及理化性能，從而改變后續粘接修復。

激光照射對牙本質粘接強度的影響各持所見，過往研究[5]顯示，Er，Cr:YSGG激光有助于提高牙本質粘接強度，也有研究[6]表明該激光對牙本質粘接強度是負面的影響。因此，有必要從更微觀的角度來探討激光對牙本質表面粘接界面的影響。通常的檢測手段都是用粘接力、剪切力實驗來證明激光對粘接強度的影響，或是簡單的用掃描電鏡圖來解釋激光照射增加牙體表面粗糙度，從而增強粘接效果。本研究運用原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）研究人牙本質在6.18～11.1 J·cm-2的Er，Cr:YSGG激光輻照前后，牙本質HA晶體微納米結構、形貌的改變，同時可通過測量得到樣品表面的三維圖像，以及其硬度、彈性、摩擦力、粗糙度等物理特性，運用能譜儀（energy-dispersive spectroscope，EDS）分析有機成分的改變，并探討相應的變化趨勢，以期對后續粘接劑的改良或激光專用型粘接劑的使用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 激光設備

本研究所用激光設備是波長為2.78μm的Er，Cr:YSGG激光（BioLaser Technology，BioLaser，美國），該激光最大輸出功率：6.0 W，輸出能量范圍：0.25～6.0 W（步進0.25 W調節），激光通過光纖直徑750μm，脈寬150μs，脈沖頻率為20 Hz。

1.2 樣本制備

選取10 d內拔除的無齲、無損傷、無脫礦及無發育不良的人第三磨牙共12顆（患者年齡在18～30歲，經患者知情同意），清潔并儲存于4℃含0.5%氯胺T溶液中備用。用低速金剛石切片刀垂直于牙體長軸在水冷卻下切除冠部1/3釉質及牙根，再垂直于牙體長軸切取1.0 mm厚度的牙本質片，每顆牙齒獲得1個牙本質片。每個牙本質片用水砂紙逐步打磨，序列拋光（600、800、1 000、1 200、1 500、2 000目），最后布絨高度拋光，超聲波清洗。

采用隨機區組設計方法，將樣本分成12個區組，每個牙本質片按順序均勻取5個部位，根據隨機數字表隨機分配，分別選取0（空白組）、6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2不同光劑量，激光通過光纖直徑750μm的Tip進行傳輸，Tip離樣品的距離為1 mm，脈寬150μs，脈沖頻率為20 Hz，步控電機光學臺控制掃描速度為1 mm·s-1，在氣/水比例為60%/70%的噴霧下激光束垂直于樣品表面進行面掃描。

1.3 AFM相位成像分析

將樣本常規干燥，按照區組分別標記，應用AFM（NanoScopeⅢa Multimode，Veeco，美國）的相位成像技術，通過輕敲模式掃描過程中振動微懸臂的相位變化來檢測激光照射部位，得出的phase圖用于分析牙本質表面有機物、無機物比例的變化，并對牙本質表面粗糙度（Rq值）進行測量。

1.4 AFM微納米形貌結構觀察

室溫下使用AFM對激光照射部位牙本質表面顆粒形貌進行觀察，采用輕敲模式成像，探針材料為硅，微懸臂的共振頻率為300 kHz，彈性系數為40 N·m-1，圖片像素采集點為256×256，掃描頻率為1.5 Hz。

1.5 EDS成分分析

樣本按照區組分別標記，用EDS（Pheonix 60S，EDAX，美國）進行微區化學成分分析。EDS所得數據應用SPSS 22.0統計軟件進行隨機區組設計的方差分析及多個樣本均數間多重比較的LSD檢驗。

2 結果

2.1 激光照射前后牙本質有機/無機成分檢測

不同能量激光照射部位牙本質表面phase圖見圖1，無機相顆粒襯度較高（黃白色部分高襯度像為無機質），有機相襯度低（灰黑色部分低襯度像為有機質），相鄰的高襯度顆粒間有低襯度像包繞，高襯度與低襯度像相互交織，彼此連接緊密。激光照射前，高襯度部分占大范圍，低襯度部分占小范圍（圖1a）；激光照射后，低襯度部分范圍減少，高襯度部分的相對比例增加，相鄰的高襯度顆粒間連接緊密（圖1b～e）。phase結果表明隨著激光強度增強，表面有機物被消融數量增加，露出無機物表面，即有機質所占的比例減少，無機質所占比例進一步增加。

圖1 不同能量密度激光照射后牙本質表面phase圖Fig 1 Phasediagram of dentin surfacewith different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

2.2 激光照射前后牙本質表面粗糙度測量

利用軟件對進一步對不同激光照射部位牙本質表面粗糙度進行測量。經Kruskal-WallisH檢驗分析，各組之間差異具有統計學意義（P＜0.05）。對不同能量密度與粗糙度之間做Spearman秩相關分析，結果顯示激光照射能量與粗糙度呈正相關，且相關性具有統計學意義（P＜0.01），說明激光照射強度的增強能明顯增加牙本質表面的粗糙度（圖2）。

圖2 不同能量密度激光照射與牙本質表面粗糙度的關系Fig 2 The roughness of dentin surface with different Er，Cr:YSGG laser irradiation

2.3 激光照射前后牙本質納米顆粒形貌觀察

利用NanoScope（R）Ⅲ5.30r1軟件對不同激光照射部位牙本質樣本進行三維處理，獲得激光輻照部位牙本質HA納米顆粒的AFM形貌圖。在1μm尺度下獲得牙本質表面的納米顆粒見圖3。激光照射前，牙本質表面納米顆粒界限較為清晰，排列緊密，顆粒大小均一（圖3a）；不同能量密度的激光輻照后，牙本質表面部分納米顆粒相互團聚，顆粒大小不均一，但仍可見清晰的納米顆粒形態，未見完全融合、增大的納米顆粒（圖3b～e）。

圖3 1μm尺度下牙本質表面納米顆粒AFM圖Fig 3 AFM images of dentine surface at 1μm scale

在650 nm尺度下，激光照射前，HA晶體呈顆粒狀，暴露的HA顆粒大小較均勻，暴露端為半球形，顆粒間鑲嵌排列且較緊密（圖4a）。激光照射后，部分納米HA顆粒相互團聚，堆垛狀成簇排列，顆粒大小不均一，但仍可見顆粒間存在界限（圖4b～e）。

圖4 650 nm尺度下牙本質表面納米顆粒AFM圖Fig 4 AFM images of dentine surface at 650 nm scale

2.4 表面元素分析

EDS測試結果顯示牙本質中除了主要的Ca、P、O、C元素外，還含有微量元素Na、Mg、Cl。不同激光照射部位C、O、Ca、P、Na、Mg元素及C/Ca、Ca/P比值（重量比）改變趨勢見圖5。

圖5 不同能量密度激光照射前后牙本質表面化學成分變化Fig 5 Chemical composition of dentine samples with different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

采用隨機區組設計資料的方差分析，結果顯示Er，Cr:YSGG激光照射后不同處理組牙本質表面元素總體均數不全相等（P＜0.05）。故進一步進行多個樣本均數間多重比較的LSD檢驗（表1），結果顯示激光照射后牙本質表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05），但4種不同能量密度間激光照射后C、O、Ca、P、Na元素及C/Ca、Ca/P比值差異無統計學意義（P＞0.05）。說明Er，Cr:YSGG激光輻照會造成牙本質表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升。激光照射對各處理組間Mg元素的差異無統計學意義（P＞0.05），說明Er，Cr:YSGG激光輻照不會引起牙本質表面Mg元素的改變。

表1 不同處理組間的牙本質表面化學成分差異性比較Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

表1 不同處理組間的牙本質表面化學成分差異性比較Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

注：各處理組間均數的LSD法多重比較結果用上標字母表示，每行中上標字母相同者差異無統計學意義（P＞0.05），字母不同者差異具有統計學意義（P＜0.05）。

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3 討論

3.1 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本質有機物及表面成分改變

探討牙本質有機膠原對粘接強度的影響時，早期的研究一直著眼于牙本質粘接混合層的形成方面。1982年Nakabayashi等[7]首次提出混合層概念，即酸蝕處理后牙本質表面脫礦，暴露出膠原纖維，粘接劑單體滲入該膠原纖維網中聚合反應后，生成的聚合物與膠原纖維相互纏繞在一起，形成了一個機械固位層。粘接樹脂和牙本質表面暴露膠原纖維在分子水平相互交聯，構成了樹脂-牙本質粘接強度的機械力學來源。隨著研究深入，發現化學作用是另一種重要的粘接力來源，膠原蛋白也起重要作用。Betancourt等[8]認為，膠原中的游離胺基、亞胺基、羥基和羧基，均可為粘接劑與牙本質的化學結合提供活性基團，粘接劑與這些離子、基團形成絡合或螯合鍵、離子鍵以及共價鍵，產生牢固的結合力。

膠原纖維的結構完整性及理化性能對粘接強度和持久度具有重要作用。然而，Sheth等[9]研究發現，膠原纖維溫度耐受能力較差，人牙本質表面溫度為60～80℃時，牙本質膠原纖維即開始變性、凝固或壞死；當溫度達100～300℃時，牙表面脫水，蛋白質和脂類等有機物發生碳化。上述改變將明顯影響復合修復材料的粘接強度。本實驗phase結果表明Er，Cr:YSGG激光照射牙本質表面有機質的減少，推測激光照射導致表層膠原纖維在瞬間的高熱高壓作用下發生變性、凝固，這樣的變化不利于后續良好粘接強度的獲得。有研究[10]表明，粘接時酸蝕處理可以增大塌陷膠原纖維束之間的空隙，促進粘接樹脂滲透，在一定程度上恢復膠原纖維的原有網狀空間結構。激光處理后牙本質再使用磷酸酸蝕可恢復膠原纖維網混合層的形成，提高激光蝕刻后牙本質的粘接效果[11]。因此，激光照射后對牙本質有機質的損傷，可以通過輔助使用酸蝕處理的方法得以彌補，進而弱化激光輻照處理對后期粘接強度的影響。同時，激光照射前后牙本質表面粗糙度增加，有助于提高后期的粘接強度。

EDS測試數據統計結果顯示激光輻照后C/Ca比例明顯下降，但各能量密度之間C/Ca比變化差異無統計學意義，此結果與phase結果說明，能量密度在6.18～11.1 J·cm-2之間，采用Er，Cr:YSGG激光輻照牙本質會引起牙本質表面的有機質分解，且在6.18 J·cm-2能量密度下就足以引其上述反應。EDS結果中，Ca、P元素的明顯升高提示激光照射后牙本質表面的溶解度下降，可能在一定程度上增強牙本質表面抗酸性，此與Resende等[12]的研究結果一致。激光照射使牙體硬組織成分發生改變，有機物、碳酸鹽及水含量減少，并導致牙本質溶解性降低，抗酸性增強。然而牙本質溶解性降低、抗酸性增強是否會影響牙體修復時粘接劑與牙體組織間的滲透、聚合仍有待進一步的研究。

3.2 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本質表面納米微形貌改變

鉺激光消融牙體硬組織的機制為：激光輻照牙體組織時，在短時間內表層牙體硬組織及其中的水分被迅速加熱，其中的水被瞬間蒸發，水蒸氣在輻照區域導致局部內膨脹，當膨脹力量超過牙體結構的晶體結合力時，牙體結構發生消融破壞[13]。上述微爆效應從激光照射的瞬間便開始，一直持續到激光能量下降。牙體硬組織消融點經歷了碳化、熔融、粗糙、熔化、重結晶、彈坑狀形成等過程，并在牙本質表面形成類似于經酸侵蝕后的不規則坑狀結構[14]。根據Lin等[15]的研究，CO2激光照射過程中發生了牙本質晶體的重結晶及晶體尺寸的增大。Nd:YAG激光也得到了類似的結果[16]。HA晶體有相當比例的離子位于晶體的表面或接近表面，有不同的理化活性，晶體的形態改變有可能影響表層硬組織的化學穩定性及與粘接材料的作用模式和效果。本研究結果證實在6.18～11.1 J·cm-2能量密度下，Er，Cr:YSGG激光輻照產生的熱機械過程會造成牙本質表面納米晶體的團聚，但未見到明顯的納米微形貌的改變。同時，該激光即使在6.18 J·cm-2能量密度下輻照牙本質，都會造成有機質的減少。

綜上所述，應用Er，Cr:YSGG激光在6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2的能量密度下輻照人牙本質，均會造成牙本質表面有機質所占的比例減少，無機質所占比例相對增加。說明在此強度下，有機質逐漸被燒灼破壞、無機質含量升高。在微納米晶體形貌方面，激光照射會造成牙本質HA納米顆粒相互團聚，但仍可見顆粒間存在清晰的界限及納米顆粒形態，未見完全融合、增大的納米顆粒。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。