短期牦牛放牧強度對川西北高原高寒草甸土壤細菌群落的影響

王永宏,田黎明,艾 鷖,陳仕勇,澤讓東科,*

1 西南民族大學青藏高原研究院, 成都 610041

2 四川大學生命科學學院, 成都 610065

3 西南民族大學畜牧獸醫學院, 成都 610041

草地是陸地生態系統的重要組分之一,全球草地覆蓋面積約為3.42×109hm2,約占陸地總面積的40%[1—2],對區域乃至全球生態系統平衡有著至關重要的作用。在過度放牧與氣候變化的共同作用下,草地出現了不同程度的退化。據報道,20世紀初我國退化草地面積已達草地總面積的90%以上[3]。青藏高原作為我國主要牧區之一,近幾十年來超過50%草地出現不同程度的退化[4]。天然草地的大面積退化不僅影響生態平衡與穩定,給環境問題帶來巨大的威脅,還影響我國畜牧業發展和廣大牧民的生活水平。青藏高原及其周邊地區牦牛保有量約占世界總量的92%(2009年統計數據)[5],但前期基于牦牛放牧同草地生態系統構件耦合關系的分析研究相對薄弱,成為探究青藏高原牦牛放牧強度對于高寒草地影響的瓶頸因子。

放牧主要通過踐踏、采食和排泄等途徑影響草地地上生物群落、土壤養分及地下微生物群落的組成和結構。大型食草動物的踐踏行為對土壤物理特性具有直接影響,研究表明冬季牛群2—3天的高強度踐踏后,土壤大孔隙減少導致水分入滲率下降,這些指標的恢復需要6個月[6]。放牧家畜對牧草的選擇性采食會改變植物群落結構,采食后通過對牧草營養成分的吸收與轉化再通過排泄的方式回歸土壤,雖然家畜的尿液和糞便僅覆蓋4%—20%和1%—5%的放牧地[7],但促進了營養物質的快速循環,從而進一步影響土壤化學性質。已發表的許多研究通過草地退化程度或與定居點和飲水點的距離來定義放牧強度大小,導致放牧強度的確定存在很大主觀性和差異,不能反映真實的放牧強度狀況,牦牛放牧強度的控制實驗結果十分缺乏。

微生物的繁殖速率快,對土壤理化性質變化的反應迅速,放牧會改變土壤pH、水分和土壤有機質等要素,進而影響土壤微生物群落的組成、結構及功能[8—9]。已有研究表明放牧可以通過增加氮礦化、反硝化、碳固定、碳降解等基因的豐度,改變微生物群落功能,增加微生物功能基因的α多樣性[10]。放牧通過家畜對營養物質的利用與轉化,改變土壤碳輸入形式,使得微生物由以真菌為主的群落結構向以細菌為主的群落轉變[11]。盡管部分研究表明放牧對細菌的α多樣性沒有顯著影響,但會影響特定細菌群落的相對豐度,從而影響細菌的群落結構[12]。全球范圍的整合分析發現,放牧通過影響地下與地上生物量使細菌生物量減少8.85%；重度放牧影響更顯著,降低幅度達16.48%[13]。現階段的研究多集中于禁牧與放牧對微生物群落的影響[10,14],土壤性質與微生物群落的相互關系則集中于土壤水分、土壤碳和土壤氮等土壤性質[12,15],而牦牛放牧強度對細菌群落結構及其調控因素的影響卻鮮見報道。

本文以青藏高原東緣典型高寒草甸為研究對象,分析不同牦牛放牧強度在短期放牧條件下(2年)對土壤理化性質和細菌群落結構的影響,并探討了二者關系,為青藏高原高寒草甸的放牧強度控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本試驗研究區位于青藏高原東緣的四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣西南民族大學青藏高原基地(32°48′N,102°33′E),海拔3504 m,年均降水量為747 mm,暖季降水可達全年降水量的80%,年均氣溫為1.5℃。試驗區的優勢植物種類為高山嵩草(Kobresiapygmaea)、垂穗披堿草(Elymusnutans)和矮生嵩草(Kobresiahumilis),土壤類型為高山草甸土。

1.2 試驗設計與樣品采集

通過對當地牧區的載畜量和退化情況進行實地調查,并對牧民進行走訪,結合相關文獻,將試驗地劃分為4個放牧處理:對照組(禁牧)、輕度放牧(1頭牦牛/hm2)、中度放牧(2頭牦牛/hm2)和重度放牧(3頭牦牛/hm2)。每個處理隨機設置3個重復,其中放牧樣地面積均為1 hm2,非放牧樣地面積均為0.33 hm2,樣地總面積為10 hm2[16]。試驗地從2008年至2014年均為當地牦牛夏季牧場,草場利用狀況較為均一,屬于中等放牧強度。為確保試驗地初始狀況較為均一,2014年將試驗地用圍欄圍封一年。放牧試驗于2015年5月下旬開始。放牧時間為每年的5月下旬到9月下旬,期間牦牛可以在樣地里自由活動、采食和飲水。2016年8月底,在各樣地中隨機選取6個50 cm×50 cm樣方,在收集地上生物量后每個樣方用土鉆采集5個0—10 cm土樣,混合成一個土壤樣品；然后將其分為兩部分,一部分帶回實驗室后在-80℃冷凍保存用于土壤細菌群落測定,另一部分自然風干后用于土壤理化性質測定。

1.3 土壤理化性質測定

將自然風干土樣去除石塊、草根等雜質后碾磨、過篩后測定土壤理化性質。各指標的測定方法分別為:土壤含水率用烘干法測定,容重用環刀法測定；土壤全氮、全磷和全鉀均使用過0.15 mm篩網的風干土樣測定,其中全氮用凱氏定氮法測定,全磷用NaOH熔融—鉬銻抗比色法測定,全鉀用火焰分光光度計法測定；土壤速效養分為過2 mm篩網后的風干土樣測定,其中有效氮用堿解擴散法測定,有效磷用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法測定,速效鉀用乙酸銨浸提—火焰光度計法測定,pH用電位法測定,土壤有機質采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定[17]。

1.4 土壤細菌DNA提取與PCR擴增

土壤總DNA用QIAamp? DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, 德國)試劑盒進行提取,并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量,用核酸檢測儀對DNA進行定量。用引物515F(5′-GTGCCAGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-GTGCCAGCCGCGGTAA-3′)對細菌16rRNA基因的V4—V5區進行PCR擴增,聚合酶為NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶。反應條件為98℃預變性2 min、98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共循環25次,最后一次循環72℃延伸5 min。將PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進行切膠回收。用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫,采用Illumina MiSeq測序平臺測序。

1.5 統計分析

利用Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME, v1.8.0)對測序數據進行處理,識別、檢查并剔除疑問序列和嵌合體序列[18],將剩余序列以97%的同一性聚類為可操作分類單位(OTU)[19]。使用QIIME的OTU表計算出OTU的α多樣性指數,并用SPSS對α多樣性指數進行單因素方差分析, 對OTU豐度矩陣在不同深度隨機抽樣繪制稀釋曲線；用UniFrac距離度量法對細菌群落結構進行β多樣性分析[20],對非加權和加權的UniFrac距離矩陣分別進行非度量多維尺度分析(NMDS)[21]；用韋恩圖確定土壤中的主要細菌群落,用Excel繪制門分類水平下的細菌組成豐度圖。使用SPSS對土壤理化性質進行單因素方差分析,使用Canoco 5.0分析環境因子對細菌的影響,用主成分分析(PCA)表明兩者間的相互關系。

2 結果與分析

2.1 不同放牧強度下的土壤理化性質

在短期放牧條件下,除土壤容重、pH、有效磷外,其它各土壤指標對不同放牧強度的響應均沒有顯著性差異(P>0.05；表1)。與對照組相比,不同放牧強度的土壤容重與土壤pH均有所降低,輕度放牧和重度放牧的土壤容重顯著小于對照組(P<0.05),土壤pH隨放牧強度的增加而減小。其它指標在不同放牧強度處理下有不同程度的增加,土壤含水率和堿解氮在各放牧強度的增加幅度相似,平均增加幅度分別為16.20%和20.37%。

表1 不同放牧強度對土壤理化性質的影響

2.2 不同放牧強度下的細菌群落多樣性

2.2.1土壤細菌OTU分布特征

通過Illumina MiSeq平臺對不同放牧強度0—10 cm土壤進行細菌群落DNA片段雙端(Paired-end)測序,樣本共測得有效序列663764條。對土壤細菌群落有效序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分,將細菌大致分類至分類學的種水平。對照組、輕度放牧、中度放牧、重度放牧的OTU種類分別為5671、5958、6231、5647,通過韋恩圖呈現出各放牧強度細菌群落共有或獨有的OTU數量(圖1)。試驗區不同種類OTU 共8492個,4個放牧強度共享的OTU占總量的37.15%；對照組獨有的OTU數占總量的4.19%；輕度放牧獨有OTU占總的4.09%；中度放牧獨有OTU占總數的5.16%；重度放牧獨有OTU占總數的3.98%。

圖1 不同放牧強度土壤細菌OTU維恩圖

2.2.2土壤細菌α多樣性

稀釋曲線能夠反映樣本的測序深度對群落微生物多樣性的說明程度(圖2),平臺期出現的測序深度順序依次為:中度放牧>輕度放牧>重度放牧>對照組,表明中度放牧處理的土壤細菌種類更多,對照組土壤細菌多樣性更低,但是各放牧強度之間的土壤細菌α多樣性指數均無顯著性差異(表2)。放牧處理的Simpson指數大于對照組,但各組間的差異很小,可見短期牦牛放牧對土壤細菌群落的均勻度和優勢OTU影響小；Chao 1與ACE指數呈現相同的規律,均為中度放牧>輕度放牧>對照>重度放牧,Shannon指數則為中度放牧>重度放牧>輕度放牧>對照組。各放牧處理間的α多樣性不存在顯著差異(P>0.05)；但結果表明中度放牧處理會增加細菌群落的豐富度與多樣性。

表2 不同放牧強度的土壤細菌α多樣性指數

圖2 不同放牧強度的細菌樣品稀釋曲線

2.3 不同放牧強度下的細菌群落組成結構

2.3.1門分類水平下的細菌群落相對豐度

在門分類水平下(圖3),土壤中相對豐度>2%的細菌分別為:變形菌門(Proteobacteria,24.7%)、酸桿菌門(Acidobacteria,21.0%)、放線菌(Actinobacteria,13.7%)、綠彎菌門(Chloroflexi,13.7%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,6.6%)、厚壁菌門(Firmicutes,4.2%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,4.2%)、硝化螺旋菌門(Nitrospira,4.0%)及浮霉菌門(Planctomycetes,2.8%)。除重度放牧的土壤綠彎菌門顯著高于對照組外,其它各菌門在不同放牧強度下沒有顯著差異。隨放牧強度的增加,放線菌、厚壁菌門、浮霉菌門的相對豐度呈先增加后減少的趨勢,酸桿菌門、芽單胞菌門則呈現先減少后增加的趨勢；疣微菌門呈現遞減趨勢,硝化螺旋菌門呈現遞增趨勢。

圖3 門分類下細菌相對豐度

2.3.2β多樣性分析

Unweighted UniFrac距離用來描述群落的組成成分差異導致的群落差異,同一放牧強度的樣本間距離較大,各樣本的群落組成成分差異明顯；不同放牧強度樣本的群落組成重合度高,表明放牧強度對土壤細菌群落組成成分變化影響不明顯(圖4)。Weighted UniFrac距離既描述了群落組成成分間的系統發育關系,又描述了各成分在群落中的豐度高低,相同放牧強度下,對照組和輕度放牧的樣本間土壤細菌群落成員豐度相近；但不同放牧強度間的UniFrac距離并沒有明顯差別,表明各放牧強度間細菌群落結構差異相似(圖4)。

圖4 不同放牧強度土壤細菌群落非加權與加權UniFrac距離 NMDS分析

2.4 不同放牧強度下細菌群落與土壤因子間的相關性分析

PCA分析(圖5)描述了門分類水平下的優勢細菌類群與土壤條件的相互關系。以土壤因子為解釋變量,第一、第二主成分的解釋率分別為53.03%和40.36%,可以很好地解釋各環境因子與細菌種群的關系。土壤全磷與酸桿菌門兩者極顯著負相關(P<0.01),與綠彎菌門為顯著正相關(P<0.05)；全鉀與浮霉菌門、厚壁菌門顯著正相關,與芽單胞菌門極顯著正相關,與硝化螺旋菌門極顯著負相關；有效磷與酸桿菌門正相關,與硝化螺旋菌門顯著正相關；而速效鉀與疣微菌門,容重與綠彎菌門呈現顯著負相關。

圖5 細菌類群與土壤因子的PCA分析

3 討論

3.1 短期牦牛放牧對土壤理化性質的影響

土壤-植被-家畜三個界面共同組成放牧系統,三者間相互影響。大量研究表明,隨放牧強度的增加,家畜的踐踏效應增強,土壤團聚體更加穩定且土壤透水性更差[22],土壤孔隙度減小,通氣性變弱,土壤持水性降低[23]。表層土壤容重隨放牧強度的增加呈現上升趨勢,土壤含水量和孔隙度則呈現遞減趨勢[24—25]。但本研究發現,不同放牧強度的含水率均高于對照組；而各放牧處理土壤容重均小于對照組,并且輕度放牧和重度放牧顯著小于對照組。這可能與試驗區的植被覆蓋情況和地下根系情況有關,本試驗為短期放牧,根據“中度干擾理論”,放牧對植被的采食行為促進植物的生長[16],地下根系更加發達,形成更穩定的草皮,有效保持了土壤含水率,降低土壤容重[26]。也可能是本試驗樣地面積較大導致土壤質地存在一定差異,從而影響土壤含水量與容重[27]。Teague等發現土壤物理性質變化是放牧長期作用的結果[28],本研究是短期放牧的結果,試驗長期進行可能會使土壤含水量降低、容重增加。

放牧活動除了影響土壤物理特性外,還能通過排泄物歸還等影響土壤化學性質。研究發現氮是決定草地初級生產力的主要因子,隨放牧強度增加土壤氮呈現增加、降低或不變的結果[29]。本研究的結果表明,全氮含量隨放牧強度增加呈上升趨勢,放牧處理的堿解氮含量也均高于對照組,但是不同放牧強度間的差異沒有達到顯著水平。這可能是因為放牧降低植物根莖的碳氮比,土壤中的分泌物減少,可利用碳不足,氮的固定減少,向氮礦化方向進行,土壤中的氮含量升高[30]。而且全氮、堿解氮與變形菌呈正相關,這與Thomson等[31]發現的高土壤碳氮含量更適合變形菌門生長的結果一致。已有研究顯示,自由放牧與圍欄封育相比全磷下降了16%,下降的主要原因是家畜的放牧活動向系統外輸出磷[32]。而本研究為短期放牧,并且排泄物完全保留于該系統內,向系統外輸出的元素含量較少；放牧使植物根系向土壤深層延伸,植物可以吸收土壤中更深層的營養元素,而牦牛采食后通過排泄物將這些營養元素回歸到土壤表層,使得放牧處理的土壤全磷含量大于對照組；糞便中的磷含量更高,放牧強度越高牦牛的排泄量越多,所以有效磷含量隨放牧強度遞增[33]。蔣建生等[34]發現家畜返還草地的鉀元素中,70%—90%通過排尿的方式,10%—30%通過排便的方式。本研究發現隨放牧強度的增加全鉀和速效鉀含量均呈先增加后減少趨勢,且放牧處理的速效鉀含量均高于對照組,這與蘇振聲等[35]的研究結果一致。牦牛從植物中采食的鉀通過排泄物,大部分以速效鉀形式回歸到土壤中,使得放牧處理的速效鉀含量高于對照組[36]；但當放牧強度增加到一定程度時,植物的補償性生長吸收了大量的鉀元素,并且由于結合在土壤膠體中的鉀很容易代換出來,使得土壤中的全鉀與速效鉀含量有所減小[35]。

3.2 短期牦牛放牧對表層土壤細菌群落組成與結構的影響

土壤微生物是生態系統中的分解者,是有機質分解與養分循環等過程中的驅動者,而細菌是這一功能群中的最大類群[37]。本研究中不同放牧強度下土壤細菌α多樣性指數差異不顯著,但整體上隨放牧強度增加呈現先增加后減少的趨勢,并且在中度放牧達到最高水平,說明適度放牧會小幅度提高土壤細菌群落的多樣性和豐富度。植物生長將土壤深層的營養物質帶到地上,再經過牦牛的采食與排泄行為將植物組織轉化為微生物容易利用的糞便與殘渣,以及牦牛踐踏作用將凋落物踏入土壤的行為[7],土壤中易分解碳增加為細菌的生長繁殖提供了有利條件。但重度放牧使地上植被大面積減少,少部分光透過表層2 mm土壤[38],增強的地表紫外線輻射直接抑制[39]或改變土壤水分條件以及通過改變植物及其根部分泌物間接抑制細菌的生長[40],導致細菌多樣性下降。楊陽等[41]發現放牧顯著降低了細菌的Simpson指數,對其它指數的影響不顯著；Li等[42]發現重度退化與不退化草地的微生物多樣性沒有顯著差異,這與本研究結果相似。但是,草地植被組成[43—44]、利用方式[14,45]、地理環境[46]、土壤類型[47]、氣候類型[10]以及家畜類型[48]等都影響土壤微生物群落的組成,可見放牧強度對土壤微生物多樣性的影響應結合環境因素進行綜合考慮。

本研究結果表明,在門分類水平下,優勢菌群為變形菌門(24.7%)、酸桿菌門(21.0%)、放線菌(13.7%)、綠彎菌門(13.7%),與本區域伍文憲等[49]對天然和人工草地的土壤微生物群落的調查結果一致。楊陽等[41]發現放牧使荒漠草原的變形菌門豐度降低；高鳳等[50]和尹亞麗等[51]均發現在門水平下放牧均降低了優勢細菌的豐度,但沒有達到顯著水平；李海云等[52]對祁連山退化的高寒草地研究發現,優勢菌門隨草地退化程度加劇呈現不同趨勢的變化。本研究發現在相對豐度>2%的9個細菌門中,除重度放牧土壤的綠彎菌門顯著高于對照組外,其它各菌門在不同放牧強度下沒有顯著差異；不同放牧強度的特有OTU占總量的3.98%—5.16%,放牧強度間的OTU相似度高；對樣本進行的β多樣性分析也表明各放牧強度樣本的重合度高,說明短期放牧對細菌群落結構的影響不顯著。綠彎菌門包含了不同生活類型的細菌,其中有一部分是自養生物,具有綠色的色素,可以進行光合作用產生能量[53],重度放牧土壤綠彎菌門顯著升高的原因可能是重度放牧改變了植被的覆蓋度,土壤裸露在陽光中,為綠彎菌門的繁殖提供了有利條件。

3.3 土壤屬性與土壤細菌群落的關系

放牧通過改變輸入土壤中的有機碳形式影響微生物的群落結構,使以真菌為主、生長速度較慢的群落向以細菌為主、生長迅速的群落結構轉變；另一方面,放牧強度增加使植物生長需要更多的有效養分,迫使細菌形成能夠更快周轉養分的細菌群落[11]。土壤中的有機碳含量以及碳磷比、氮磷比均與細菌群落結構顯著正相關[50],使得細菌群落結構能夠反映土壤的情況。本試驗的有機質與放線菌門呈正相關,這是因為放線菌門與調控麥芽糖酶和淀粉酶表達的易分解有機碳降解基因顯著正相關[54]；而酸桿菌門與土壤有機質呈負相關,Fierer等[55]通過實驗與整合分析結合,證實了酸桿菌門在低碳含量土壤中豐度較高,碳礦化能力低,其原因是酸桿菌門與難降解有機碳降解基因(調控纖維素酶和木聚糖酶等)呈正相關[54],不利于土壤有機質的快速循環,降低了碳礦化能力。

氮是陸地生態系統循環的重要限制因子,微生物參與其固氮、氨化、硝化以及反硝化等過程[56]。變形菌門與酸桿菌門作為本研究區土壤中豐度最高的兩種細菌群落,通過冗余分析發現,其比例越高土壤的氮含量越高,Thomson和Smit等人的研究也發現了同樣的結果[31,57]。主要因為變形菌門中的部分細菌中檢測到nifH基因的存在,對于固氮有重要作用[58]。硝化是氮循環的核心部分,氨氧化作為硝化的限速步驟,在高氮水平下其優勢類群之一的硝化螺旋門細菌生長更加旺盛[59],本試驗全氮和有效氮均與硝化螺旋菌門呈正相關,但由于短期放牧,各放牧強度間的土壤氮含量差異不顯著,土壤氮與硝化螺旋菌門的相關關系并不顯著。nirS和nirK作為氮循環反硝化過程的標記基因,廣泛存在于變形菌門、酸桿菌門和厚壁菌門中,并且這些反硝化功能基因豐度與土壤的總碳、有機質、速效鉀以及有效磷顯著相關[58]。這些結果表明,放牧對土壤細菌群落的影響可能是通過改變土壤性質間接實現。

近年來由于人為的氮輸入,部分生態系統的氮限制得到緩解,磷限制現象增加[60]。土壤磷對氮有礦化作用[61],可以提高土壤有效氮從而改變微生物群落結構,本研究發現有效磷與酸桿菌門正相關,與硝化螺旋菌門顯著正相關,這與上文提到的氮對細菌群落結構影響結果一致。Zheng等[62]通過氮、磷、鉀等施肥處理發現,施肥平衡能夠顯著增加細菌的數量,而導致細菌活性降低缺乏的主要營養物質是有效磷。但本研究短期放牧各強度的主要細菌群落差異不顯著,無法確定缺乏有效磷主要通過影響何種細菌種群進而影響細菌群落整體活性的。因此,需要通過長期放牧實驗來探究細菌群落結構變化的閾值,從而揭示細菌群落對放牧強度更加明顯的響應規律,為生產實踐提供更加有效的理論依據。

4 結論

短期的牦牛放牧行為會降低土壤表層的容重,可能是由植物的補償性生長導致地下生物量增加或土壤異質性引起的；家畜加快物質循環的作用導致短期內有效磷在地表的聚集,使有效磷隨放牧強度的增加呈上升趨勢。放牧對土壤理化性質的影響是長期的,因此短期牦牛放牧強度變化不容易改變相對數量。牦牛的活動為細菌提供了更有利的營養條件,雖然短期的放牧強度對細菌群落組成的影響不顯著,但放牧強度過高改變了植物根系和分泌物以及增加紫外線輻射使細菌的多樣性降低。不同細菌類群對土壤碳氮磷的響應通過其功能基因實現,可以由細菌群落結構指示土壤營養成分組成。由于本試驗為短期放牧(2年),土壤屬性以及細菌群落響應并不顯著。由此可見,開展長期牦牛放牧強度控制實驗對揭示土壤性質與微生物的影響及其機理以及探究土壤-植物-微生物間的相互關系至關重要。