甘薯蔓割病拮抗菌株KC2-8的篩選、鑒定及紫外誘變

張靜珍， 靳曉杰， 王連軍， 柴沙沙， 龍 同，楊園園， 程賢亮， 楊新筍*， 雷 劍*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室/湖北省甘薯工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430064； 2.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心/湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 武漢 430064)

甘薯蔓割病是我國南方甘薯種植區(qū)的主要病害，為導(dǎo)管系統(tǒng)病害，主要危害甘薯蔓莖基部，也可侵染薯塊，發(fā)生規(guī)律與溫度密切相關(guān).2011年，湖北省在調(diào)查主要甘薯病害中發(fā)現(xiàn)，全省多地均發(fā)生了甘薯蔓割病的危害，部分產(chǎn)區(qū)發(fā)病率30%以上，對甘薯產(chǎn)業(yè)影響巨大[1].甘薯蔓割病的發(fā)生隨機性較強，可使甘薯減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時可減產(chǎn)50%以上.近年來，在長江中下游區(qū)域發(fā)現(xiàn)有甘薯蔓割病的發(fā)生.甘薯蔓割病的主要致病真菌為尖孢鐮刀菌甘薯專化型(Fusariumoxysporumf.sp.batatas,Fob)，是一種具有較強腐生和寄生能力、分布較為廣泛的土傳性真菌病害，可侵染茄科、瓜類、棉花、香蕉、豆類及花卉等多種植物，引起枯萎病.

目前，尖孢鐮刀桿菌的主要防治方法有：培育抗病新品種，利用化感物質(zhì)及化學(xué)藥劑防治結(jié)合農(nóng)業(yè)措施.如，吳振新[2-3]研究表明，利用50%菌靈可濕性粉劑1 000倍液和20%噻森銅懸浮劑600倍液浸苗10 min，晾干后種植，結(jié)合有機肥的施用，可大大降低甘薯蔓割病的發(fā)病率.化學(xué)殺菌劑使用效果雖好，但是存在潛在風(fēng)險.張鴻等[4]通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化篩選非致病突變體試驗，獲得3株非致病突變體，可與蔓割病菌發(fā)生營養(yǎng)競爭作用抑制菌絲生長，從而為甘薯蔓割病生物防治提供了理論基礎(chǔ).因此，以生物防治為主，代替化學(xué)防治的研究對尖孢鐮刀菌的防治具有重要意義[5].

芽孢桿菌為革蘭氏陽性桿菌，存在于植物微生態(tài)和土壤中，是優(yōu)勢生物種群，能在逆境下形成內(nèi)生芽孢以抵抗不良環(huán)境[6]，例如：耐酸堿、紫外、高溫等；制劑成本低，易加工，安全性和穩(wěn)定性較好；促進(jìn)植物生長，增加產(chǎn)量，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[7].目前，芽孢桿菌已成為生物農(nóng)藥研發(fā)熱點[8]，如王波等[9]通過一株多粘類芽孢桿菌XZ-2對甘薯黑斑病的生防效果和作用機理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，利用稀釋10倍的XZ-2發(fā)酵液處理貯藏期薯塊可有效抑制黑斑病孢子萌發(fā).

本文以實驗室保存的菌株為研究對象，篩選對尖孢鐮刀菌甘薯專化型具有高效拮抗活性的菌株，對篩選出來的菌株KC2-8進(jìn)行分子鑒定，并通過紫外照射時間的變化對原始菌株進(jìn)行誘變，篩選到抗真菌生物活性較高的新突變株，從而更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實踐.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

尖孢鐮刀菌甘薯專化型由徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供.供試菌株KC2-2、KC2-8、KC6-5由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離鑒定和保存.

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯(去皮)200 g，煮沸20 min，過濾加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃滅菌20 min.

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃滅菌20 min.

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

將經(jīng)LB培養(yǎng)基活化的KC2-2、KC2-8、KC6-5分別接種于PDA培養(yǎng)基兩側(cè)，再將5 mm的尖孢鐮刀桿菌菌餅接種于培養(yǎng)基中間，以只接種病原菌的PDA平板為對照，每個處理3個重復(fù).置于28 ℃暗培養(yǎng)箱內(nèi)96 h，待對照長滿整個平板時觀察菌株對病原菌的拮抗效果.抑菌率公式如下：

其中D表示直徑.

1.4 分子生物學(xué)鑒定

將待測菌株KC2-8接種到LB液體培養(yǎng)基上，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，將菌液直接作為DNA模板進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增總體系為25 μL，包括菌液DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，Master mix 12.5 μL.擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后，由天一輝遠(yuǎn)公司測序.測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站通過BLAST程序進(jìn)行同源性比對，并用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining Tree)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 紫外誘變實驗

1.5.1 液體菌種的制備將KC2-8菌株活化后,菌餅放至LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h.

1.5.2 紫外誘變菌液濃度的確定分別取6支盛有9 mL無菌水的試管，依次編號為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，另取盛有LB無菌培養(yǎng)皿9套，編號10-4，10-5，10-6各3皿.將枯草芽孢桿菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，吸取1 mL離心后的菌液上清加到10-1試管中，振蕩混勻，再將10-1的菌懸液取1 mL加入到10-2試管中，其余試管依次類推.分別精確吸取10-4、10-5、10-6的稀釋液0.1 mL，對應(yīng)加入已編號培養(yǎng)皿中，涂布均勻，待菌液稍干后，倒置，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，對編號10-4、10-5、10-6培養(yǎng)皿的菌落進(jìn)行計數(shù).

1.5.3 KC2-8菌株的紫外誘變將KC2-8菌株活化后，取適量菌液10 000 r/min離心2 min，用生理鹽水稀釋成濃度為107～108個/mL，再取100 μL制備好的菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行5、10、15、20、30 s的紫外誘變，通過平板計數(shù)法估算單菌落數(shù)量(n)，以未經(jīng)輻照的涂布平板為對照組估計致死率，以決定最佳輻照時間.致死率為

1.5.4 誘變菌株的篩選將紫外誘變后的菌懸液稀釋至一定倍數(shù)，取100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)紫外誘變照射不同時間后，28 ℃ 12 h暗培養(yǎng)，將平板上菌落直徑大、生長迅速的單菌落涂布接種至斜面PDA培養(yǎng)基，4 ℃保存.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選和16S rDNA分子鑒定

2.1.1 尖孢鐮刀菌的拮抗菌株篩選通過平板對峙法檢測3株細(xì)菌對尖孢鐮刀桿菌的拮抗作用.由圖1可知，菌株KC2-8對尖孢鐮刀桿菌抑制作用最強，抑菌圈最大，抑菌率為62.2%.菌株KC6-5的抑菌效果次之，抑菌率為52.4%，KC2-2的抑菌效果最差，抑菌率為50.0%.

圖1 3株細(xì)菌對尖孢鐮刀桿菌的拮抗圖Fig.1 Antagonistic diagram of three bacterial strains against Fusarium oxysporum

2.1.2 拮抗菌株的分子生物學(xué)鑒定以菌株KC2-8菌液為DNA模板，采用細(xì)菌通用引物16S rDNA進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增、回收、測序.測得KC2-8菌株16S rDNA基因片段長度為1 402 bp.將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示：與菌株KC2-8相似性最高的為Bacillusmojavensis，相似度達(dá)到99%.從圖2可以看出，菌株KC2-8與BacillusmojavensisstrainHM753629.1和BacillustequilensisstrainKT982221.1同屬于一個遺傳分支，親緣關(guān)系十分接近，菌株KC2-8與BacillusmojavensisstrainHM753629.1在BLAST比對過程中的相似度為99.93%，與BacillustequilensisstrainKT982221.1的相似度為100%，最終將KC2-8確定為特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis).

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的KC2-8菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogentic tree based on sequence of 16S rDNA of strain KC2-8

2.2 拮抗菌株KC2-8的紫外誘變

2.2.1 紫外(UV)照射時間對KC2-8菌株致死率的影響KC2-8經(jīng)不同誘變時間后，計算單菌落的個數(shù)、菌株的致死率并繪制UV誘變致死率曲線，結(jié)果顯示(圖3)：KC2-8菌株對紫外誘變較為敏感，隨著誘變時間的增加，致死率呈上升趨勢，在10～20 s致死率上升速度最快，UV 照射20 s致死率為89.6%，30 s致死率高達(dá)99.2%，故選擇UV照射 20 s為最佳誘變時間.

圖3 UV誘變時間與致死率的關(guān)系Fig.3 Relationship between time of UV mutagenesis and mortality

2.2.2 KC2-8誘變高產(chǎn)菌株的篩選通過平板對峙法篩選高產(chǎn)菌株，結(jié)果如圖4所示，共篩選出10株(UV1—UV10)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)誘變菌株，紫外誘變時間：CK，0 s；UV1，5 s；UV2，10 s；UV3、UV4，15 s；UV5、UV6，20 s；UV7、UV8，25 s；UV9、UV10，30 s.

圖4 KC2-8紫外誘變后復(fù)篩菌株發(fā)酵液對峙尖孢鐮刀桿菌生長的抑制圖Fig.4 Inhibition of Fusarium oxysporum growth in fermentation broth of KC2-8 strain after ultraviolet mutagenesis

10株誘變株抑菌活性如圖5所示：菌株KC2-8的抑菌能力隨著紫外照射時間增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢.在尖孢鐮刀桿菌對峙中，UV5—UV10菌株抑制率高于原始菌株,其中:UV7抑菌效果最好，抑菌率為48.9%，較原始菌株的抑菌率提高了4.0%,UV8和UV9表現(xiàn)次之，抑菌率為48.4%，較原始菌株KC2-8提高了3.5%，且UV5—UV9的抑菌率差異不顯著.UV1—UV4較CK抑菌率減少了3.6%～6.2%，抑菌效果較差.

圖中不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05).圖5 KC2-8紫外誘變后復(fù)篩菌株發(fā)酵液對峙尖孢鐮刀桿菌生長的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of KC2-8 fermentation broth byUV radiation on the growth of fusarium oxysporum

3 討論與結(jié)論

大量研究表明：生防菌，如芽孢桿菌具有內(nèi)生固氮、防治病害等生物學(xué)作用且對人畜無害，對環(huán)境友好.其生防機制主要表現(xiàn)在拮抗病原菌[10-14]、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[15-17]、溶解病原菌[18]、競爭[19]等方面.特基拉芽孢桿菌是Gatson等[20]從墨西哥的一個墓穴中首次分離得到的，它是一種廣譜拮抗菌，可有效抑制黑曲霉、毛霉菌[21]、小麥赤霉病菌[22]、桑樹地杖菌[23]、煙草黑脛病菌[24]、西瓜枯萎病菌[25]、大豆炭疽病菌[26]等.近年來，特基拉芽孢桿菌分離提取在國內(nèi)外已有較多研究，如：Paliya等[27]從城市生活垃圾處理廠中分離出好氧降解的特基拉芽孢桿菌，為污染環(huán)境中PBDEs的生物修復(fù)提供了新的解釋；Nayarisseri等[28]從微咸水中分離鑒定出一株新型的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，即特基拉芽孢桿菌.Pradhan等[29]研究發(fā)現(xiàn)，特基拉芽孢桿菌通過產(chǎn)生生物表面活性劑等物質(zhì)，破壞病原菌的生物膜，以達(dá)到抑菌效果.而特基拉芽孢桿菌開發(fā)利用仍有待研究.江蘇師范大學(xué)邢珂等[30]申請了一種產(chǎn)揮發(fā)性抑菌氣體的特基拉芽孢桿菌的專利，特基拉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對植物病原菌有強烈的拮抗作用，可顯著抑制其致病力，對遠(yuǎn)距離防治植物病原菌具有參考價值.

本研究通過平板對峙對3個菌株進(jìn)行篩選，篩選到一株對Fob具有拮抗活性的菌株KC2-8，該菌可有效抑制Fob的擴(kuò)散.利用16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為特基拉芽孢桿菌BacillustequilensisstrainKT982221.1.通過對KC2-8進(jìn)行紫外誘變，選擇20 s為最佳誘變時間，致死率為89.6%.通過平板對峙篩選得到6株穩(wěn)定突變株，其中UV7抑菌率高達(dá)48.9%，隨著誘變時間的增加，抑菌率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢.本研究結(jié)果可為由尖孢鐮刀桿菌F.oxysporum引起的甘薯蔓割病的防治提供參考，但是對KC2-8菌株的抑菌活性物質(zhì)及其對甘薯蔓割病的田間防治效果尚需進(jìn)一步研究.