作物異源附加系創建方法及應用

祿小溪 孟珊 沈新蓮 王凱

摘要：異源附加系是克服植物遠緣雜交障礙和開展遺傳研究的中間材料，可用于基因定位、構建外源漸滲系群體、創新種質資源、開展外源染色體配對和重組等研究。著重闡述了構建作物異源附加系的常規法、橋梁法、雙重單體或多重單體附加法、單倍體法、回交法、細胞融合法、自交法，對異源附加系的形態學鑒定、原位雜交、細胞學鑒定、分子標記鑒定方法和異源附加系在基因定位、種質資源創新的應用等方面的研究進展，對異源附加系的研究現狀進行了總結，以期為作物野生資源的利用提供參考。

關鍵詞：異源附加系;染色體;野生種;種質資源創新

中圖分類號：S330;S334 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0010-06

收稿日期：2021-04-29

基金項目：國家自然科學基金（編號：31801047）。

作者簡介：祿小溪（1996—），女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：lupeixuan357@gmail.com。

通信作者：王 凱，教授，主要從事作物分子細胞遺傳學研究。E-mail：kwang5@126.com。

1個（或1對）異源染色體被添加到另一個物種的染色體組中，被稱為異源附加系[1]。根據作物細胞中附加的異源染色體的個數，異源附加系可以分為單體異源附加系（monosomic alien addition lines，簡稱MAALs）、雙體異源附加系（disomic alien addition lines，簡稱DAALs）、多體異源附加系（multiple alien chromosomes alien lines，簡稱MACALs）等。單體異源附加系：附加了1條異源染色體的附加系;雙體異源附加系：附加了1對異源染色體的附加系;多體異源附加系：附加了3條及3條以上異源染色體的附加系。MAALs的構建己經在一些作物中完成，并且已經應用到作物育種和遺傳基礎研究中，其中一部分單體異源附加系己經在小麥[2-7]、水稻[8]、大豆[9-10]、燕麥[11-12]、棉花[1，13-17]、玉米[18-19]、煙草[20]、甘藍[21]等中被構建。

1 異源附加系構建方法

異源附加系的幾種主要構建方法：常規法、橋梁法、雙重單體或多重單體附加法、單倍體法、細胞融合法等。

1.1 常規法

常規法是目前構建異源附加系最經典也是應用最廣的方法，通過種間或屬間雜交獲得雜種F1，并通過秋水仙素加倍F1產生雙二倍體，將雙二倍體與1個親本回交數代，得到單體附加系、雙體附加系、多體附加系。OMara通過此常規法得到了小麥-黑麥異源附加系[22]。Shigyo等利用此方法獲得了一套完整的日本大蔥（Allium fistulosum L.）-小洋蔥（A. cepa L. var. aggregatum）單體異源附加系[23]。Singh等利用短絨野大豆（2n=78）與栽培大豆（2n=40）雜交后使用此方法獲得了一系列異源單體附加系和異源二體附加系[10]。李鵬飛將白菜型油菜（AA）與黑芥（BB）雜交產生F1（AB），再使用秋水仙素加倍F1的染色體數，使其成為芥菜型油菜（AABB），后再與白菜型油菜（AA）回交，獲得了白菜型油菜-黑芥異源附加系[24]。Chen等通過澳洲棉與陸地棉雜交，用此方法構建了一套完整的13個陸地棉-澳洲棉附加系，其中有11個單體異源附加系和2個多體異源附加系[14]。Meng等利用異常棉與陸地棉雜交，用此方法并結合SSR分子標記技術，鑒定出一整套13個陸地棉-異常棉單體異源附加系[17]。

1.2 橋梁法

橋梁法是指當2個親本由于親緣關系較遠時，造成雜交不親和時，先利用與2個親本較易成功雜交的中間材料作為橋梁親本，再按照常規法選育出所需要的異源附加系。栗根義等利用由人工合成的甘藍型油菜作為橋梁材料，選育出白菜-甘藍異源附加系[25]。Chetelat等利用番茄野生種（Solanum lycopersicoides Dun.）與番茄栽培種（Lycopersicon esculentum Mill.）雜交后產生F1，再以潘那利番茄（L. pennellii）衍生的橋梁品系與F1雜交，獲得一系列異源附加系，克服了F1與栽培番茄回交的不育和不相容性障礙[26]。王紅林用四倍體玉米（2n=40）、四倍體指狀摩擦禾（2n=72）、四倍體多年生大芻草（2n=40）遠緣雜交創制出異源近六倍體 MTP-1（2n=74），再以該異源近六倍體為橋梁材料與玉米進行回交，在BC3代獲得2個玉米-大芻草單體異源附加系[18]。

1.3 雙重單體或多重單體附加法

雙重單體或多重單體附加法是指通過利用雙重單體、多重單體異源附加系自交，產生二體異源附加系的方法，解決了單體異源附加系自交產生二體異源附加系頻率低的問題。呂文欣等利用附加了結球甘藍1號和6號染色體的大白菜雙單體異源附加系為材料，從其自交后代的38個植株中，篩選出3株大白菜-結球甘藍1號染色體二體異源附加系[27]。楊曉菲利用普通小麥-濱麥抗條銹病的雙單體附加系（2n=44=42T.a+L.m2+L.m3）其中，T.a代表小麥染色體;L.m2表示濱麥第2部分同源群染色體，L.m3表示濱麥第3部分同源群染色體）進行自交，在自交后代中篩選出含有一對L.m2濱麥染色體的普通小麥-濱麥的二體異源附加系[28]。

1.4 單倍體法

指對遠緣雜種F1或倍半二倍體的花藥或者子房進行組織培養，獲得染色體組成為（n+1）的單倍體植株，再經過染色體加倍，可獲得雙體異附加系，縮短育種時間。張永泰等對甘藍型油菜-白芥單體異源附加系進行小孢子培養，獲得單倍體植株后，用秋水仙素加倍單倍體植株的染色體數，獲得雙體異源附加系[29]。Wang等通過組織培養甘藍型油菜-海甘藍單體異源附加系的小孢子，再利用秋水仙素加倍其染色體，得到了甘藍型油菜-海甘藍雙體異源附加系[30]。

1.5 回交法

1.5.1 回交、自交法

使不同染色體倍數的2個親本雜交后，使F1與其中1個親本進行回交后再自交得到異源附加系的方法。西北農林科技大學農學院染色體工程實驗室通過中國春與卵穗山羊草SY159雜交得到F1后與中國春回交，再進行連續自交，Wang等從該雜交的BC1F6群體中篩選出7Mg二體附加系[31];龍得雨等從該雜交的BC1F8群體中鑒定出的其衍生后代1003，是抗白粉病和條銹病的小麥-卵穗山羊草二體異源附加系[4]。Song等通過普通小麥與歐山羊草（Aegilops biuncialis）的遠緣雜交獲得F1，F1植株以普通小麥為雄性親本連續回交2次，然后自交，最終獲得小麥-歐山羊草Ae. biuncialis 5Mb二體異源附加系[32]。

1.5.2 倍半二倍體回交法

不同染色體數目的2個親本雜交后，產生的F1為擁有其中1個親本的全部染色體，另1個親本的半數染色體的倍半二倍體，使F1再與其中1個親本回交產生附加系的方法。Suen等將皺葉煙草（Nicotiana plumbaginifolia，PP，2n=20）和美花煙草（N. sylvestris，SS，2n=24）雜交，獲得的F1倍半二倍體（PPS，2n=32）與親本皺葉煙草回交，最終獲得了皺葉煙草-美花煙草異源附加系[20]。鄭寶智等利用大白菜-結球甘藍異源三倍體（AAC，2n=3x=29）與親本大白菜（AA，2n=2x=20）進行回交，從BC1、BC2回交世代自交的后代中，獲得附加了甘藍9號染色體的大白菜-甘藍單體異源附加系植株[33]。譚晨等利用甘藍（CC，2n=18）與黑芥（BB，2n=16）雜交獲得了三倍體雜種（CCB，2n=26），以其為母本與甘藍連續回交3代，獲得了7種甘藍-黑芥異源附加系[21]。

1.6 細胞融合法

又名原生質體融合法，指不能直接進行有性雜交的植物體細胞，去掉其細胞壁后成為原生質體，再誘導2個原生質體互相融合形成異核體，異核體生出細胞壁后，再進行有絲分裂時會發生核融合，從而實現體細胞雜交，最后獲得雜交種，使雜交種植株與親本回交，可以獲得異源附加系，有效解決了難題，實現了親緣關系遠的物種遺傳物質的轉移。Ali等使用馬鈴薯-番茄體細胞雜交種與親本馬鈴薯進行回交，在馬鈴薯背景中建立完整的外源番茄染色體附加系，篩選出5種馬鈴薯-番茄異源單體附加系和1種二體附加系[34]。Kang等利用甘藍型油菜（AACC，2n=38）與中國菘藍（II，2n=14）的體細胞雜交獲得雜種（AACCII，2n=52），使雜種再與甘藍型油菜回交，獲得32株異源單體附加系[35]。王桂香等將花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）與黑芥葉肉原生質體融合獲得雜種，使雜種再與花椰菜進行回交，從后代中篩選出20份花椰菜-黑芥異源附加系[36]。丁力用甘藍型油菜（AACC，2n=38）和諸葛菜（OO，2n=24）的體細胞雜種與甘藍型油菜進行連續回交，在回交后代中獲得了9種甘藍型油菜-諸葛菜單體、二體異源附加系[37]。

1.7 自交法

自交法是指使不同染色體倍數的2個親本雜交后，獲得的后代再連續自交，從而獲得異源附加系的方法。羅賢磊用硬粒小麥（AABB）與小偃麥8801（AABBEE）雜交得到F1后再連續自交，從自交后代中獲得了分別附加了2E、4E染色體的硬粒小麥-長穗偃麥草單體異源附加系[38]。

2 附加系的鑒定

目前，鑒定異源附加系的主要方法：形態學鑒定、原位雜交、細胞學鑒定、分子標記鑒定等。

2.1 形態學鑒定

指能在雜種后代中被直接觀察到的外觀性狀，如株型、花色、葉色、花藥色、鈴的形狀、種子大小、抗病性等，而特定性狀一般對應特定基因，因此通過肉眼觀察到與栽培種不同的雜種后代的獨特性狀，可以初步判斷植株是否攜帶異源染色體。形態學鑒定是檢測植株是否含有異源染色體的最簡單、最直接的方法，但是容易受到外部條件影響，因此需要和其他鑒定方法結合使用。周仲華通過葉片性狀觀察和分子標記檢測，從陸地棉-索馬里棉異源六倍體與陸地棉的回交后代中，鑒定出2個異源單體附加系[39]。任艷蕊等通過花瓣的特殊表型，在選育甘藍-菜薹（CC+A）異源附加系時選育出染色體組成為（2n+1）的植株[40]。

2.2 原位雜交

原位雜交是指將特定標記的已知核酸序列為探針，用探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸進行精確定位的過程。原位雜交一般在細胞標本或組織標本上進行。鑒定附加系常用的原位雜交技術有2種，先發展的是熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH）技術，在其發展的基礎上又建立了基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，簡稱GISH）技術。FISH技術是發展于20世紀80年代末的新技術，以放射性原位雜交技術為基礎，以非放射性分子生物學和細胞遺傳學相結合，是以熒光標記取代同位素標記的一種新型原位雜交方法。GISH技術是利用供體的基因組DNA作為探針，標記過的探針與外源特異序列結合，使外源染色體產生熒光雜交信號，進而使用熒光顯微鏡能直接觀察到外源染色體或片段。張紹松等利用篩選出的分子標記檢測和FISH技術，檢測出了甘藍型油菜-蘿卜附加系附加的染色體在F2代中的遺傳穩定性[41]。吳金華等利用細胞學、GISH技術鑒定了普通小麥-黑麥1R雙體異附加系抗白粉病品系的黑麥遺傳物質[42]。

2.3 細胞學鑒定

細胞學鑒定主要包括核型分析（配對行為、染色體數目、著絲粒位置等）和染色體分帶（C-帶、N-帶等）。根據核型分析確定染色體組成情況，但無法區分哪一條是外源染色體;染色體分帶利用C-帶技術區分染色體。任曉琴等根據花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ染色體配對情況及染色體C-分帶，在中國春-大賴草雜種回交后代中選育出穩定的二體異源附加系[43]。高東杰等通過利用細胞學技術，觀察到栽培甜菜-白花甜菜單體異源附加系有絲分裂中期的染色體核型，計算出附加的染色體長度與栽培甜菜染色體長度的比值（簡稱染色體比值），用以鑒別單體附加系類別[44]。袁世峰等應用植物細胞學方法，通過對甘藍型油菜與埃塞俄比亞芥種間雜種衍生后代的根尖細胞染色體數的鑒定，以及花粉母細胞減數分裂染色體行為的觀察，鑒定出甘藍型油菜B組染色體附加系[45]。

2.4 分子標記

DNA分子標記指可遺傳并可檢測的DNA序列，它在DNA水平上直接反映個體的遺傳變異，具有簡單、迅速、準確的特點，在識別異源染色體和鑒定異附加系上得到了廣泛應用。郭長虹等篩選出殺配子染色體特有的RAPD標記，并檢測普通小麥與3種山羊草之間的RAPD多態性，鑒定了3個中國春具殺配子染色體的雙體異源附加系及作為3個殺配子基因種源的3種山羊草[46]。張麗等成功將AFLP標記轉化為更穩定、操作更簡單的序列標記位點（STS）標記，這些標記可用于小麥-長穗偃麥草異源附加系中長穗偃麥草遺傳物質的檢測[47]。Edet等使用PCR和DArTseq SNP標記篩選出10個小麥-濱麥異附加系，其中有4個單體附加系和6個雙體附加系，表明適當的分子標記可在不進行原位雜交的情況下生產和鑒定小麥異源附加系，從而節省了大量時間和精力[48]。Hechanova等利用野生稻（Oryza rhizomatis）特異性的InDel標記結合形態學和細胞學，鑒定出一套完整的栽培水稻-野生稻單體異附加系[49]。Tan等通過SSR標記和FISH技術相結合，得到7個附加了不同B基因組染色體的甘藍-黑芥單體異源附加系和1個帶有B2染色體的三體附加系[50]。Zhou等通過RAPD分子標記與細胞學和形態學相結合，分析鑒定出2個陸地棉-索馬里棉單體附加系，對棉花改良有重要意義[1]。Sarr等使用SSR分子標記和基因組原位雜交，鑒定出5個新的陸地棉-澳洲棉單體異源附加系[13]。Chen等利用SSR分子標記技術，鑒定出13個陸地棉-澳洲棉附加系[14]。Chen等使黃瓜栽培種與野黃瓜進行雜交，利用RAPD標記與細胞學，鑒定出2個栽培黃瓜-野黃瓜單體附加系[51]。

3 附加系的應用

由于異源附加系附加的是整條或多條染色體，因此不僅會轉入優異的基因，同時也會轉入許多不利的基因。因此，異源附加系一般作為橋梁親本用于基因定位、構建外源漸滲系群體（染色體文庫）、促進種間優異基因的漸滲等。

3.1 基因定位

一套完整的單體異源附加系把供體親本的基因組分為單個染色體，每條染色體都處于相同的受體親本遺傳背景下，因此供體基因組內染色體間的相互影響被消除，可將一些顯性性狀定位到特定染色體上，利用分子標記可以把相應的基因定位到染色體上。Li等通過GISH技術和特異性位點擴增片段測序（SLAF-seq）對小麥-冰草（Agropyron cristatum）衍生系5113進行鑒定，證明是1個新型的小麥-冰草二體6P附加系。與其親本Fukuho相比，5113表現出多種優異農藝性狀，包括最上部節間/株高比更高、旗葉更大、穗長更長、每穗粒數和每穗小穗數增多、中穗粒數增多、每株可育分蘗數增多、抗白粉病和葉銹病能力增強。利用SLAF-seq標記分析Fukuho與5113雜交產生的雙親群體（F1、BC1F1和BC1F2群體），將這些優異性狀的基因定位在冰草6P染色體上[52]。王丹利用分子標記輔助選擇（marker assisted selection，簡稱MAS），綜合GISH和FISH技術分析，鑒定出一套輝縣紅-荊州黑麥異附加系。再利用22個6R專化標記進行染色體臂定位，結果表明，荊州黑麥6RL攜帶有高抗白粉病基因[53]。王文泉利用反復干旱法對整套小麥-冰草二體附加系的抗旱性進行鑒定，結果表明，冰草的抗旱性可能涉及較多的基因位點，單個附加系的抗旱性均弱于冰草，抗旱基因主要分布在2P、4P、6P和7P染色體上;對小麥-冰草二體附加系抗寒性的鑒定表明，多基因控制的抗寒基因主要分布于冰草的4P和6P染色體上[54]。Meng等對構建出的一套13個陸地棉-異常棉單體附加系進行表現性狀調查，并與陸地棉進行對比，發現附加了3B染色體的MAAL比陸地棉親本有明顯高的纖維強度和低馬克隆值，分別附加了8B和9B染色體的MAAL的纖維強度也明顯高于陸地棉親本，表明異常棉的3B、8B、9B染色體可能包含賦予改善纖維強度和細度的基因[17]。Chen等將構建的12個陸地棉-澳洲棉單體附加系與親本陸地棉相比較，發現附加了3Ga染色體的MAAL有非常高的衣分百分比和正常的纖維長度，表明澳洲棉的3Ga染色體可能具有控制種子指數的基因;附加了8Ga染色體的MAAL葉片具有高濃度的葉綠素a和葉綠素b，表明澳洲棉的8Ga染色體可能包含提高葉綠素含量的基因[14]。

3.2 種質資源創新

培育異源附加系的最終目的就是把野生種的有利基因漸滲入栽培種的基因組中，從而改良栽培種。異源附加系由于基因組不穩定，在育種中很難直接利用，因此需要作為中間橋梁材料，通過同源重組、輻射、殺配子等方法，構建一系列異代換系、易位系、漸滲系等，從而實現將野生種優異基因更好地導入栽培種。發展成套MAALs將為外源物種基因組和遺傳學研究提供了一種新型工具[11]。

異源附加系在不同的作物中應用廣泛，在小麥中報道最多。張雅莉等采用1200 R 60Co-γ射線處理的小麥-大賴草二體附加系DA7Lr的花粉授予已去雄的普通小麥中國春，獲得了具有1條普通小麥-大賴草易位染色體的植株，為小麥抗赤霉病遺傳改良提供了新種質[55]。劉淑會等利用“缺體回交法”以小大麥二體異源附加系WBA9816作父本與阿勃缺體小麥雜交，創制小大麥異代換系，F1再用該異源附加系回交，回交后代通過細胞學鑒定，篩選出2n=43的雙單體植株進行套袋自交，從自交后代群體培育出WBS02126，田間試驗結果顯示，WBS02126表現弱春性、葉片寬厚上挺、葉色淡綠、棒狀穗、小穗排列緊密、長芒、早熟、綜合抗病性好[56]。

在水稻中，趙慶華采用源于烏干達的緊穗野生稻（O. eichingeri，CC，2n=24）與栽培稻02428（O. sativa L. japonica，AA，2n=24）雜交，從其后代中篩選出附加了第11號染色體的異源染色體單體附加系。利用該單體附加系，通過體細胞無性繁殖獲得一個無性系群體，利用SSR分子標記鑒定出了漸滲系群體，并篩選出一些有明顯性狀變化的漸滲材料[57]。Hechanova等獲得了栽培水稻-野生稻單體異附加系衍生的二體漸滲系，一些漸滲系表現出對褐飛虱和綠葉蟬的抗性[49]。唐明等利用一個嵌合型栽培稻-藥用野生稻7號染色體單體附加系與栽培稻回交，獲得了漸滲了藥用野生稻染色體片段的回交后代，漸滲片段改變了回交后代的株高、千粒質量、結實率、葉寬等質量性狀[58]。

在番茄中，Mangat等獲得由番茄-類番茄單體附加系衍生的漸滲系，該漸滲系在形態學上更像栽培番茄，但出現了與栽培番茄及單體附加系缺乏的新表型，表明該漸滲系捕獲了新的遺傳變異，其中2個漸滲系表現出了耐旱性[59]。

在油菜中，丁力用表型為鋸齒葉的甘藍型油菜-諸葛菜附加系與甘藍型油菜缺體（2n=36）雜交，獲得也表現為鋸齒葉的代換系[37]。Li等對甘藍型油菜-菘藍單體附加系的自交后代進行篩選，獲得一個具有良好雄性育性的含有少量菘藍來源的DNA片段的雙單倍體恢復系，該恢復系對花粉和種子育性以及低硫代葡萄糖苷含量有很大改善[60]。

4 展望

異源附加系是將野生近緣物種的優異基因轉入栽培種中的橋梁材料，由于附加系染色體數目的非整倍性，使得基因組并不穩定，在育種中很難直接利用，因此需要通過同源重組、殺配子、輻射等方法進一步構建漸滲系、易位系等種質資源。但異源單體附加系（MAAL）是在栽培種完整的基因組背景下，添加了1條外源染色體的情況，可以以栽培種為對照組，研究供體親本的單個染色體。這對一些顯性性狀基因在染色體上的定位更有優勢，能使定位更快更精準。進行基因定位后，更能進一步構建單個外源染色體的漸滲文庫，為未來的育種工作和基因功能研究提高效率。

目前，關于異源附加系的構建研究已經在多種作物中實現，但大部分研究進行的都是種間雜交，只有少數幾個科創建了屬間雜交異源附加系，如十字花科蕓薹屬甘藍型油菜和諸葛菜屬諸葛菜的異源附加系的創建[37];禾本科燕麥屬燕麥和玉蜀黍屬玉米附加系的創建[19];茄科茄屬馬鈴薯和番茄屬番茄附加系的創建等[34]。未來育種工作者們可以擴大雜交范圍，嘗試進行更多的屬間雜交，拓寬作物栽培種遺傳多樣性。附加系的應用方面研究還主要集中在小麥、水稻等少數幾個作物上，在其他農作物和蔬菜等作物上的研究相對較少，今后要進一步加強對不同作物中附加系應用的研究，對作物育種領域有重要意義。

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