新疆發現甜菜新病害甜菜黃萎病

趙志強，張盧慧，趙全新，郭慶元

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大的甜菜生產區，也是我國北方最大的甜菜糖制糖基地[1]。2018年，全區甜菜種植面積已達57 260 hm2，占全國種植總面積的26.49%；全區甜菜總產量為424.73×104t，占全國總產量的37.66%[2]。2016年以來，在新疆多個地區的甜菜上發現了一種新病害，可以造成甜菜葉片褪綠、黃化、萎蔫，直至枯死，且半葉發病者居多。查明引起新疆甜菜黃萎癥狀的病原，研究病害性質，需采集病樣，分離純化，運用柯赫氏法則驗證及對病原物形態觀察和分子鑒定，研究該病原及所致病害類別，對該病有效防治有實際意義。【前人研究進展】根據相關文獻報道，在新疆甜菜產區發生較為普遍或為害較大的病害有根腐病、立枯病、褐斑病、白粉病和叢根病等[3]。甜菜黃萎病的發生也有報道，但迄今國內對甜菜黃萎病的認識一直是將其作為植原體病害來理解的[4-5]。由于植原體病害在病原鑒定上存在一定的難度，國內有關甜菜黃萎病的報道多以病害的發生調查和防控為主，對其病原菌的研究較少[4-5]。國外曾報道，變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)均為甜菜黃萎病的病原[6-7]。【本研究切入點】新疆部分甜菜種植區內發現一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，葉片常表現為黃化、萎蔫，直至枯死，且以半葉黃化居多，而國內文獻對此尚無報道。需研究該病病原及病名。【擬解決的關鍵問題】以傳統形態學分類為基礎，結合核糖體內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer，ITS)、核糖體大亞基(Large subunit rDNA, LSU)及肌動蛋白(Actin, ACT)基因進行多基因系統學分析，研究該病原物分類地位，并為該病定名，為該病發生發展規律及防治技術研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年8月在新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地調查甜菜病害，從伊犁州伊寧縣阿熱吾斯塘鄉、察布查爾縣奶牛場周邊及昌吉市周邊采集多份具有典型黃萎癥狀的病葉樣品。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用常規組織分離法對采集的甜菜病樣分離病原菌。將葉柄用無菌水洗凈、晾干，在超凈臺上用75%乙醇浸潤1 min，在病健交界處切取輕度變色維管束組織(約2 mm×2 mm)用2%NaClO液消毒2 min后，再用無菌水沖洗3次，置于濾紙上晾干，最后放在 PDA培養基上25℃恒溫培養。待7 d左右長出菌落后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲在PDA上進行培養，通過單孢分離法獲得各分離物的純培養。將純化的所有菌株(菌株編號：BV1～BV5)在PDA斜面培養基上培養10 d后保存于4℃冰箱備用。選取典型菌株進行形態學觀察、致病力測定以及分子鑒定。

1.2.2 致病性測定

采用牙簽針刺法[8]測定致病力。將直徑為6 mm的病原分離物菌餅接種在PDA培養基中心，再把10根經121℃，30 min滅菌的細小牙簽(直徑1 mm，長25 mm)尖端向心，呈放射狀排列在菌餅周圍，28℃恒溫培養，待菌絲覆蓋牙簽尖端約10 mm時，取出帶菌牙簽，針刺接種于室內盆栽的甜菜健株(品種新甜6號)的葉柄基部。共接種5株，每株接種3個葉柄，共15個重復，并以剌入無菌牙簽的健株葉柄(5株，15葉)為對照。接種后將甜菜植株于室內培養，每天觀察，待發病后統計發病情況，并從發病葉片再次分離病原物。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌的形態

將回接證病試驗確定其致病性的菌株接種于PDA培養基上，28℃恒溫培養20 d左右，觀察并記錄菌落特征和菌體顯微形態特征，以及是否產生厚垣孢子、休眠菌絲及微菌核等休眠結構。

1.2.3.2 病原菌rDNA-ITS、LSU、ACT片段的PCR擴增和序列測定

依據病原菌形態學鑒定和致病力驗證結果，將分離所得致病菌接種在PDA培養基上于28℃培養15 d后刮取菌絲，再用液氮將菌絲充分研磨，利用植物基因組提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH 公司，DP320-03)提取菌絲基因組DNA。

以25 μL的反應體系在PCR儀(DL9700，北京東林昌盛生物科技有限公司)上擴增ITS、LSU及ACT基因。反應體系如下：2 ×rapPCR Master mix 13 μL，正向、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足至25 μL。ITS基因PCR擴增反應程序如下：94℃預變性4 min，94℃變性1 min,55℃退火1 min，72℃延伸1 min，總共37個循環，最后72℃延伸10 min；LSU基因PCR擴增反應程序如下：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火55 s，72℃延伸1.5 min，總共28個循環，最后72℃延伸10 min。ACT基因PCR擴增反應程序如下: 94℃預變性2 min，94℃變性 1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環，最后72℃延伸7 min。擴增產物4℃保存。變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列的擴增片段及引物。表1

取5 μL PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，以2 000 bp DNA Marker為參照，檢測產物片段大小。上海生工對該擴增產物測序，將測序后的序列在核酸序列數據庫GenBank中進行序列同源性比對并提交，利用軟件MEGA5.05比對并構建系統發育樹。

表 1 擴增片段及其引物Table 1 Primer sequence for PCR amplification

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀

研究表明，在中國新疆伊寧縣、察布查爾縣及昌吉市周邊的甜菜種植區內發現一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，該病害主要癥狀表現在甜菜葉部，感病后輕者葉片黃化萎蔫，植株矮縮，重者枯死，且以中脈為界半葉發病者較多，疑為甜菜真菌性黃萎病。經田間病害高發期為7～9月，發病田可見大量的甜菜黃萎病病株。發病初期一般老葉先黃化，輕病株僅下部葉片黃化枯萎，重病株除心葉外全部葉片黃化枯萎(圖1A)；病葉上有明顯的沿葉脈擴展，致脈間黃化(圖1B)，或半葉黃化枯萎(圖1C)。發病后期感病葉片邊緣向內卷曲，萎蔫，直至整個葉片枯死。剖檢葉柄可見維管束略有變色，但不顯著。上述癥狀與茄子黃萎病等多種植物真菌性黃萎病癥狀相似。而在調查中未見植株明顯矮化，新葉短小、狹窄等癥狀[4]，該病有別于植原體黃萎病。判斷此病為真菌性黃萎病。圖1

圖1 甜菜黃萎病田間癥狀Fig.1 Sugar beet yellow wilt Symptoms on naturally infected leaf

2.2 病原菌的分離及致病性

研究表明，新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地采集的10份病樣，約40個分離塊上以較高頻率分離到一種與輪枝菌菌落形態及產孢結構相似的真菌，分離頻率約40%。并純化獲得5個典型菌株。

接種8 d后甜菜幼苗開始顯癥，部分接種葉出現脈間褪綠、黃化，或局部萎蔫干枯等癥狀(圖2A)，接種發病率約12%。接種15 d后，部分接種葉片黃化、枯死(圖2B)；接種發病率約為71%；而無菌牙簽接種的幼苗長勢良好未出現發病癥狀(圖2C)。在被侵染葉片中可再次分離出與接種菌形態一致病分離物。人工牙簽針刺接種引起的發病癥狀與田間自然發病癥狀基本一致。圖2

注：A，B.發病甜菜植株；C.健康甜菜植株

2.3 病原菌的培養性狀及菌體形態特征

研究表明，菌株在PDA培養基上生長較為緩慢，菌落初期呈白色，氣生菌絲不發達，表面常有大小不等的白色菌絲團，并產生灰白色粉末及同心輪紋，邊緣較為整齊，培養后期菌落逐漸變為灰黑色，菌落背面灰黑至黑色(圖3A)。菌絲體中有明顯的輪枝狀分生孢子梗，分生孢子梗細長無色，常有二次輪狀分枝，即分支小梗輪生于分生孢子梗上，產孢小梗又呈輪枝狀著生于分生小梗上，一般每輪3～4根小枝并常在枝端聚集成容易散落的孢子球(圖3B)，長度為25～45 μm(30 μm avg.)。分生孢子無色透明，呈圓形或橢圓形，大小為3.7～6.8×1.8～3 μm(n=100)(圖3C)；其休眠體為厚垣孢子，卵圓形、球形或不規則形，深褐色，一般3～5個串生，直徑5.5～8.5 μm(n=100)，成熟后彼此間分散(圖3D)；不產生微菌核與休眠菌絲。與大麗輪枝菌有明顯區別，而與已報道的Gibellulopsisnigrescens[7]的形態描述比較一致。圖3

注：A.PDA培養基上的菌落；B.分生孢子梗；C.分生孢子；D.厚垣孢子 標尺：B,C,D=20 μm

2.4 病原菌ITS、LSU及ACT序列

研究表明，對BV4菌株ITS、LSU、ACT區進行PCR擴增和產物序列測定，分別獲得長度為525、879和261 bp的片段。將所測菌株序列提交至GenBank，獲得序列登陸號分別為MG824977.1、MH229355.1和MN700655.1。利用該菌株序列在NCBI中進行BLAST比對，確定親緣關系最近的種屬。從數據庫中獲得相關序列，通過軟件MEGA5.05，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹。結果顯示：菌株BV4的ITS序列與G.nigrescens(MG855143.1)在同一分支，同源性為99%；LSU序列與Gibellulopsisnigrescens(MH866593.1)在同一分支，同源性為99%；ACT序列與Gibellulopsisnigrescens(JN18840.1)在同一分支，同源性為100%。

甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)，其病害為甜菜真菌性病害，可命名為甜菜黃萎病(Sugar beet Gibellulopsis yellow wilt)。圖4～圖7

圖4 基于ITS、LSU、ACT基因擴增的電泳圖Fig 4. The PCR amplification product of ITS、LSU and ACT sequences

圖5 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ITS序列系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA-ITS sequence

圖6 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的LSU序列系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA - LSU sequence

圖7 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ACT序列系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on ACT sequence

3 討 論

Pethybridge[12]在1917年從馬鈴薯塊莖中分離得到一種真菌，通過形態學的分類方法將其歸屬于Plectosphaerellaceae科Verticillium屬，并將其命名為VerticilliumnigrescensPethybr.(中文譯名為變黑輪枝菌)。在2007年，對該菌ITS和LSU序列的進化樹進行分析，結果發現該菌株歸屬于Plectosphaerellaceae科，Gibellulopsis屬，最終將其拉丁名定名為Gibellulopsisnigrescens[7,13]。在2011年，Inderbitzin等[14]又基于多個基因對輪枝菌建立了新的分類框架，Verticillium屬內共包含10個種，并又將黑白輪枝菌細分為3個種，即為黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)、苜蓿輪枝菌(Verticilliumalafalfae)和非苜蓿輪枝菌(Verticilliumnonalfalfa)。G.nigrescens與Verticillium屬內種不易區分，但各菌種在PDA培養基上培養2周后均菌絲休眠結構略有不同。黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)分別以暗褐色菌絲體或菌核作為休眠結構；三體輪枝菌(Verticilliumtricorpus)可同時產生厚垣孢子、休眠菌絲、微菌核3種休眠體；云狀輪枝菌(Verticilliumnubilum)和變黑輪枝菌(G.nigrescens)僅可產生深褐色厚垣孢子，而云狀輪枝菌厚垣孢子的直徑(8.4～17.5 μm)明顯大于G.nigrescens的直徑(5.3～8.1 μm)[12,15-17]。由于G.nigrescens在形態上與輪枝菌屬內近似種的分生孢子梗大小、輪狀分枝小梗數目、分生孢子大小上的差異不明顯，而且隨著培養環境的變化，一些形態特征可能不會穩定表現，僅從形態上區分仍然較為困難[18]。

真菌ITS序列是介于與5.8S rRNA、18S rRNA及28S rRNA之間的區域，其序列不加入成熟核糖體，進化速率較快且更易突變累計，其在種內高度保守，種間差異較為明顯。屬內種間和亞種間的分類鑒定常以ITS序列為依據[19]。近年來，據文獻報道，在種內鑒定中ITS的區分度不是很理想，這說明利用單獨特定片段作為DNA條形碼具有一定的局限性。因此，結合其他序列作為輔助鑒定就顯得很有必要[20]。核糖體大亞基(LSU)序列是一段相對保守的位于25～28S的RNA序列[21]，Zare通過分析LSU序列，完成了輪枝菌屬內種間的物種鑒定，并發現新的分類單元。ITS與LSU序列已逐漸成為鑒定大部分絲狀真菌的DNA條形碼[22]。ACT基因也常作為多基因聯合鑒定中的基因之一來區分輪枝菌屬內種與G.nigrescens[14]，在菌物鑒定過程中，采用多基因位點來識別和鑒定已逐漸成為趨勢。因此，研究分析了變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列，也證明這3個基因可以將變黑輪枝菌與其它近似種進行區分。其中，分離菌株的ACT基因與G.nigrescen的ACT基因的同源性高達100%，且在該序列比對結果中未出現輪枝菌屬相關種，因此，目前可將ACT基因作為首選片段將其近似種區分，從而達到快速鑒定的目的。

甜菜黃萎病的病原菌包括變G.nigrescens和V.dahliae，但關于甜菜來源的G.nigrescens報道甚少。多地曾報道甜菜黃萎病的發生，經鑒定其病原菌均為V.dahliae[6,23-25]。而Zare[7]在2007年曾報道G.nigrescens可引起甜菜黃萎病，這與研究結果一致。研究從采集到的甜菜病株上未分離出V.dahliae，可能與采集的病樣數較少有關。新疆甜菜種植區分布較廣，甜菜真菌性黃萎病是否存在由V.dahliae與G.nigrescens復合侵染的情況，有待于廣泛采樣開展進一步研究。

20世紀70、80年代，國內外大量報道均將植原體作為甜菜黃萎病病原，其癥狀描述也與研究觀察到的癥狀有不少相似之處，是否存在植原體、G.nigrescens、Verticillium屬內致病種混合侵染的情況或其病原種類是否存在地域差異有待進一步研究。

目前，國內還未見甜菜來源的G.nigrescens的報道，但據已有報道，G.nigrescens寄主種類較為繁多[26]。1982年，陳吉棣[27]從馬鈴薯、菜豆、茄子、豇豆和芹菜等植物上分離出G.nigrescens；1987年，王克榮[28]從棉花黃萎病病株中分離出G.nigrescens，并發現其在棉花上表現弱致病力；2009年，段維軍[29]在寧波從進境芹菜中分離出G.nigrescens；2010年，Hu等[30]從苜蓿分離出一株G.nigrescens。該菌寄主范圍較廣。今后宜對各寄主的危害情況及該菌在甜菜等多種作物的潛在風險評估，以及針對該病害的控制方法開展進一步的研究。

4 結 論

新疆甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌，其病害可命名為甜菜黃萎病，是變黑輪枝菌在甜菜上的國內新寄主記錄。