定量核磁共振法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)

蘇 鳳,汪一帆

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate),商品名格列衛(wèi),是一種由諾華公司開發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑[1]。2001年5月,甲磺酸伊馬替尼經(jīng)FDA的批準(zhǔn)在美國(guó)上市,2002年在中國(guó)正式銷售,作為費(fèi)城染色體陽性慢性粒細(xì)胞白血病加速器、急慢性和α-干擾素治療失敗后的首選治療藥物[2-7]。甲磺酸伊馬替尼作為一種有機(jī)酸鹽,目前常用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Iiquidchromatograph mass spectrometer,LC-MS)[9]等。由于甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)特性,應(yīng)用這些方法進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定時(shí)均需要被測(cè)樣品的對(duì)照品,在配制流動(dòng)相的過程中往往會(huì)添加三乙胺或者離子對(duì)試劑如辛烷磺酸鈉等,但在質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相平衡時(shí)間過長(zhǎng),且重現(xiàn)性差[10],在離子對(duì)試劑的使用過程中,對(duì)色譜柱有一定的損害,使色譜柱使用壽命和柱效降低[11]。

近年來,定量核磁共振技術(shù)(Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)逐漸被用于藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定中,原理是不同環(huán)境下響應(yīng)信號(hào)的積分強(qiáng)度與化合物中被激發(fā)質(zhì)子數(shù)成正比[12]。利用qNMR方法,既能夠?qū)衔锝Y(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定歸屬,又可以利用分子結(jié)構(gòu)中特定基團(tuán)的質(zhì)子數(shù)與其相應(yīng)譜峰的峰面積之間的正比關(guān)系進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定,方法簡(jiǎn)單快捷,特異性強(qiáng),不破壞樣品,可使用已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的普通化學(xué)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo),而不必使用待測(cè)物的對(duì)照品,適合無對(duì)照品的新化合物的定量測(cè)定[13-17]。NMR定量常見方法分為相對(duì)定量法和絕對(duì)定量法,其中絕對(duì)定量法適用于無對(duì)照品的新藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定[18]。qNMR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[19]、藥學(xué)[20-21]、生物學(xué)[22]和食品[23]等諸多學(xué)科領(lǐng)域。筆者在前期研究工作的基礎(chǔ)上[24-26],對(duì)甲磺酸伊馬替尼的1D,2D NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬,建立了甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的qNMR方法。到目前為止,尚未見到有關(guān)采用qNMR方法對(duì)甲磺酸伊馬替尼進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的報(bào)道。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料與試劑

甲磺酸伊馬替尼原料藥,江蘇八巨藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):201704008);甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品,上海源葉生物科技有限公司(批號(hào):G28O6K5134,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%);順丁烯二酸對(duì)照品,中國(guó)食品藥品檢定研究院(馬來酸,批號(hào):VLD6-3BQZ,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%);氘代二甲基亞砜,美國(guó)Sigma公司(DMSO-d6,99.9% D);乙酸銨,天津市永大化學(xué)試劑有限公司(分析純,批號(hào):2014G705,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%);乙腈,美國(guó)TEDIA公司(色譜純,批號(hào):20095293,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)。

1.2 儀器與條件

所有NMR實(shí)驗(yàn)均在600 M AVANCE Ⅲ核磁共振儀上進(jìn)行,NMR譜圖處理均在Bruker Topspin 3.5.6軟件上完成,對(duì)每幅圖進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正。采集條件是zg 90脈沖序列,溫度為298 K,譜寬(SWH)為12 019 Hz,采樣點(diǎn)數(shù)(TD)為30 s,掃描次數(shù)(NS)為32次。甲磺酸伊馬替尼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用計(jì)算公式為

(1)

式中:Ix為樣品定量峰積分面積;Nx為樣品定量峰代表的氫個(gè)數(shù);Mx為樣品分子量;Wx為樣品稱樣質(zhì)量;Istd為內(nèi)標(biāo)峰積分面積;Nstd為內(nèi)標(biāo)峰代表的氫個(gè)數(shù);Mstd為內(nèi)標(biāo)分子量;Wstd為內(nèi)標(biāo)稱樣質(zhì)量;Pstd為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

所有HPLC實(shí)驗(yàn)均在Agilent 1260上完成。采集條件是Welch Welchrom-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),測(cè)定波長(zhǎng)254 nm,流動(dòng)相V(乙腈)∶V(1%醋酸銨水溶液)=60∶40,柱溫30 ℃,流速0.7 mL/min。

1.3 溶液配制

1.3.1 NMR內(nèi)標(biāo)溶液和供試品溶液制備

精密稱取馬來酸對(duì)照品11 mg,置于2 mL容量瓶中,加入約2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度線,得內(nèi)標(biāo)溶液。

精密稱取甲磺酸伊馬替尼原料藥25.35 mg,置于2 mL容量瓶中,加入約2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度線,得供試品溶液。

1.3.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

精密稱取5.3 mg的甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品,置于10 mL容量瓶中,加入V(乙腈)∶V(水)=60∶40的溶劑溶解后定容至刻度線,再分別稀釋成0.02,0.05,0.1,0.2,0.4 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)歸屬

甲磺酸伊馬替尼的化學(xué)名為4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸鹽。甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)式為

甲磺酸伊馬替尼1D NMR譜圖如圖1所示。由圖1(a,b)可知:除溶劑峰(DMSO-d6)外共有34個(gè)氫質(zhì)子和23組碳信號(hào),其中碳信號(hào)結(jié)合圖1(c),可知共有12組伯碳或叔碳,3組仲碳,其余為季碳,部分碳原子由于化學(xué)結(jié)構(gòu)特性,其化學(xué)位移重疊在一起。

圖1 甲磺酸伊馬替尼1D NMR譜圖Fig.1 1D NMR spectrum of imatinib mesylate

甲磺酸伊馬替尼2D NMR譜圖如圖2所示。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)與位移可以將δ2.22處的質(zhì)子歸屬于H-24,結(jié)合圖2(b)中直接相連的碳?xì)潢P(guān)系,將δ17.56處的碳?xì)w屬為C-24。根據(jù)圖2(c)中遠(yuǎn)程偶合的碳?xì)潢P(guān)系,該處質(zhì)子與δ133.98處的碳信號(hào)相關(guān)聯(lián),可推出δ133.98為C-21。在圖2(b)中,C-21與δ7.20～7.21處質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將δ7.20～7.21處的質(zhì)子歸屬于H-22和H-22,對(duì)應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ129.96,碳信號(hào)歸屬于C-22;在圖2(a)中,同一碳上的氫質(zhì)子有耦合關(guān)系,H-22與δ7.48～7.49處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將該處的質(zhì)子歸屬于H-23,對(duì)應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ116.75,碳信號(hào)歸屬于C-23。根據(jù)結(jié)構(gòu),C-18是季碳,結(jié)合圖2(c)和圖1(c),可推出C-18化學(xué)位移為δ137.06;在圖2(c)中,C-18與δ8.07～8.08處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),推出該處的質(zhì)子為H-19,由圖2(b)可以推出碳信號(hào)化學(xué)位移δ117.24為C-19;在圖2(c)中,H-19與δ137.74處有相關(guān)點(diǎn),又根據(jù)圖1(c)顯示該處碳信號(hào)為季碳,可以推出碳信號(hào)為C-20。

圖2 甲磺酸伊馬替尼2D NMR譜圖Fig.2 2D NMR spectrum of imatinib mesylate

化合物結(jié)構(gòu)中共有3組仲碳,根據(jù)結(jié)構(gòu)可以判斷此處仲碳對(duì)應(yīng)的質(zhì)子峰信號(hào)在高場(chǎng),且峰型為單峰,將δ3.64處的氫歸屬為H-8,根據(jù)圖2(b),將δ60.34處的碳?xì)w屬為C-8;在圖2(c)中,H-8與δ40.84處的碳有相關(guān)點(diǎn),結(jié)合圖1(c),可以推出δ140.84處的碳信號(hào)為C-9,在圖2(c)中,C-9和δ7.94～7.95處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將δ7.94～7.95處的質(zhì)子歸屬于H-11和H-13;在圖2(b)中,將δ127.63處的碳信號(hào)歸屬為C-11和C-13;在圖2(a)中,δ7.94～7.95與δ7.45～7.46處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將δ7.45～7.46處的質(zhì)子歸屬為H-10和H-14;在圖2(b)中,將δ128.71處的碳信號(hào)歸屬于C-10和C-14;在圖2(c)中,H-11和H-13與δ134.35處有相關(guān)點(diǎn),將δ134.35歸屬為C-12;在圖2(c)中,H-8與δ49.18處有相關(guān)點(diǎn),將δ49.18處的碳信號(hào)歸屬為C-2和C-6,此處碳信號(hào)為仲碳,可以推出δ2.33和δ2.91處的質(zhì)子分別為H-2a,H-6a和H-2b,H-6b;在圖2(a)中,此2處質(zhì)子同時(shí)與δ2.89和δ3.04處的質(zhì)子相關(guān),推出該2處質(zhì)子分別為H-3a,H-5a和H-3b,H-5b,根據(jù)圖2(b),將δ52.71處碳信號(hào)歸屬為C-3,C-5。

由于羰基在碳譜中的位移處于低場(chǎng),故將δ164.99處碳信號(hào)歸屬為C-15。在圖2(c)中,C-15與δ10.15處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將該質(zhì)子歸屬為H-16;在圖2(c)中,C-20與δ8.95處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將該質(zhì)子歸屬為H-25;在圖2(c)中,H-25與δ161.54有相關(guān)點(diǎn),結(jié)合圖1(c),該處碳信號(hào)為季碳,將該碳信號(hào)歸屬為C-26;在圖2(c)中,C-26與δ8.50～8.51處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將該質(zhì)子歸屬于H-30,根據(jù)圖2(b),將δ159.41處碳信號(hào)歸屬于C-30;在圖2(a)中,H-30與δ7.42～7.43處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),將該處質(zhì)子歸屬于H-29,根據(jù)圖2(b),將δ107.46歸屬為C-29;在圖2(c)中,H-29與δ161.14處的碳信號(hào)有相關(guān)點(diǎn),且該處為季碳,將δ161.14歸屬為C-28;在圖2(c)中,C-28與δ9.27～9.23和δ8.46～8.48處的質(zhì)子有相關(guān)點(diǎn),根據(jù)結(jié)構(gòu)以及峰形,將δ9.27～9.23歸屬為H-37,δ8.46～8.48歸屬為H-33;在圖2(b)中,將δ132.16歸屬為C-33,δ148.13歸屬為C-37;在圖2(c)中,C-33與δ7.50～7.52處有相關(guān)點(diǎn),將該處質(zhì)子歸屬于H-34,在圖2(b)中,δ123.70歸屬為C-34;在圖2(c)中,C-34與δ8.67～8.68有相關(guān)點(diǎn),將該處質(zhì)子歸屬為H-35,在圖2(b)中,將δ151.29歸屬為C-35;由于受到氮原子的電負(fù)性影響,與氮相連的甲基應(yīng)在較低場(chǎng),故將δ2.79歸屬為H-7,δ2.31歸屬為H-4′;在圖2(b)中,將δ39.91歸屬為C-4′,δ42.16歸屬為C-7。

甲磺酸伊馬替尼的1D及2D的NMR結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)歸納整理如表1所示。

表1 甲磺酸伊馬替尼的NMR數(shù)據(jù)Table 1 NMR data of Imatinib Mesylate

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

馬來酸是常用的定量核磁共振法內(nèi)標(biāo)物,內(nèi)標(biāo)物馬來酸既不干擾待測(cè)物峰信號(hào),又在DMSO-d6中有較好的溶解度,因此馬來酸可作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)的溶解性,選擇DMSO-d6作為溶劑,由于高場(chǎng)區(qū)質(zhì)子信號(hào)密集,因此選擇低場(chǎng)區(qū)的質(zhì)子信號(hào)作為定量峰,待測(cè)物甲磺酸伊馬替尼低場(chǎng)區(qū)質(zhì)子信號(hào)分別選擇為δ7.21～7.22,δ7.43～7.44,δ7.54～7.56,δ8.103～8.106作為定量峰,并且與溶劑峰δ2.50、內(nèi)標(biāo)物馬來酸定量峰δ6.26互不干擾。甲磺酸伊馬替尼與馬來酸(MA)的1HNMR譜圖(DMSO-d6)如圖3所示。

圖3 內(nèi)標(biāo)組、樣品含內(nèi)標(biāo)組、樣品組的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of IS, sample with IS, and samples

2.3 線性關(guān)系考察

采用1.3.1節(jié)的試品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液,2種溶液按V(供)∶V(內(nèi))分別為2∶5,3∶4,1∶1,4∶3,5∶2混合后至0.7 mL搖勻,分別精密量取混合溶液0.6 mL加至核磁共振樣品管中測(cè)試,以橫坐標(biāo)X為m(甲磺酸伊馬替尼)∶m(馬來酸),縱坐標(biāo)Y為定量峰面積,得到回歸方程為Y=0.097 6X-0.005,相關(guān)系數(shù)r=0.999,m(甲磺酸伊馬替尼)∶m(馬來酸)為0.92～5.77時(shí)與定量峰面積比呈良好線性。

2.4 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取甲磺酸伊馬替尼5.97 mg,馬來酸對(duì)照品5.82 mg,溶解于0.6 mL DMSO-d6中,振蕩,轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中,按1.2節(jié)的條件連續(xù)測(cè)定5次,甲磺酸伊馬替尼和馬來酸定量峰峰面積比的RSD為0.93%。結(jié)果顯示該方法精密度良好,其結(jié)果如表2所示。

表2 儀器精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision test results of instrument

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取甲磺酸伊馬替尼樣品6 mg,馬來酸對(duì)照品5 mg用0.6 mL DMSO-d6溶解,混勻。平均配制6份。按1.2節(jié)的條件測(cè)定,算出甲磺酸伊馬替尼定量峰面積與稱樣量比值的RSD為1.6%,甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%。結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好,其結(jié)果如表3所示。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability test results

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.4節(jié)的樣品,室溫放置時(shí)間分別為0,4,8,12,18,24 h,測(cè)定其定量峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積比的RSD為1.08%,表明樣品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定性良好,其結(jié)果如表4所示。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Stability test results

2.7 HPLC法與qNMR法測(cè)定結(jié)果對(duì)比

對(duì)于甲磺酸伊馬替尼原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定,參考了《印度藥典》2010年版中對(duì)甲磺酸伊馬替尼的規(guī)定,甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品在質(zhì)量濃度為0.4～0.02 mg/mL時(shí)與峰面積X線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=89 602X-129.44,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,平行配制3份樣品溶液,取峰面積平均值,得出甲磺酸伊馬替尼原料藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%。HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果與qNMR方法對(duì)比測(cè)得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果98.6%基本一致。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)建立了qNMR方法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼原料藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)。定量峰的選擇主要依據(jù)以下規(guī)則:1) 定量峰與其相鄰峰的分離度好,易于識(shí)別;2) 定量峰對(duì)應(yīng)氫質(zhì)子的化學(xué)結(jié)構(gòu)盡量與內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)相似,化學(xué)位移相近,減小誤差;3) 定量峰對(duì)應(yīng)的氫質(zhì)子為非活潑氫。在甲磺酸伊馬替尼的氫譜中,4處的共振峰δ在7.21～7.22,7.43～7.44,7.54～7.56,8.103～8.106均為芳環(huán)上SP2雜化碳上的氫,各之間均具有良好的分離度,同時(shí)內(nèi)標(biāo)馬來酸中的定量峰也為SP2雜化碳上的氫,化合物環(huán)境相似。因此,實(shí)驗(yàn)中選擇4處化學(xué)位移的共振峰作為定量峰。在定量核磁實(shí)驗(yàn)中不需要引入任何校正因子及特定的對(duì)照品,所需的樣品量少,對(duì)待測(cè)物無破壞性,而且檢測(cè)時(shí)間快,通過與HPLC定量法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,顯示質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果準(zhǔn)確。在采用HPLC測(cè)定有機(jī)酸鹽時(shí),不僅流動(dòng)相的配制操作繁瑣,而且對(duì)色譜柱的使用及壽命造成影響,不適合測(cè)定有機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在采用qNMR方法對(duì)化合物定量的同時(shí),還可以通過1D,2D NMR譜圖歸屬出化合物分子結(jié)構(gòu),滿足對(duì)甲磺酸伊馬替尼進(jìn)行質(zhì)量控制的要求。