N-甲基-D-天冬氨酸受體在腦創傷介導急性肺損傷過程中的作用

周松，樓穎穎，錢梅姿

顱腦創傷（TBI）可導致全身多系統損害和功能紊亂[1]，其中腦創傷介導的急性肺損傷（TBI-ALI）是其常見的并發癥，致病率達20%～25%[2]。同時肺損傷也是TBI繼發死亡的主要原因之一，這類患者的致殘率和病死率是未合并TBI-ALI的1.5～2倍，嚴重影響著TBI患者的轉歸[3]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是神經系統中的一種興奮性谷氨酸受體，當興奮性氨基酸谷氨酸增多時，可激活NMDAR介導Ca2+內流，通過引起Ca2+超載而激活細胞內一系列機制介導細胞死亡，參與多種神經系統疾病的發生、發展過程[4]。近年研究發現，NMDAR亦可通過擴大炎性反應的進展加劇肺損傷過程[5]。本研究將通過激活和抑制NMDAR，探究其在TBI-ALI模型中的作用機制。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 清潔級C57BL/6小鼠40只，體質量21～22 g，8周齡，購買于上海實驗動物中心。術前12 h禁食，自由飲水。本研究獲溫州醫科大學實驗動物倫理委員會審核批準（wydw 2020-0537）。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機將小鼠分為4組（n=10）：正常對照組（Sham組）、腦損傷組（TBI組）、TBI+谷氨酸注射組（TBI+Glu組）及TBI+MK-801組（TBI+MK-801組）。

1.2.2 模型制備 采用控制性皮層沖擊法制備TBI模型[6]。首先通過1.5%戊巴比妥鈉（0.1ml）進行麻醉，選擇小鼠前囟和“人”字縫之間左側顱骨的位置，剪開皮膚約1 cm暴露顱骨，打開骨膜，穩定小鼠頭部后持鉆進行左側顱骨鉆孔。當有明顯落空感時停止鉆孔，隨后將小鼠置于腦立體定位儀上固定，選定打擊參數為深度2mm，時間100 ms，速度3.5 m/s。打擊后立即將小鼠取下并置于保溫毯上恢復。密切觀察記錄小鼠生命體征，待呼吸平穩后方可縫合傷口并放回籠內飼養。Sham組除不打擊外，其余操作與TBI組相同。谷氨酸（Solarbio G0010 1mg/kg）及MK-801（MedChemExpress HY-15084 0.1 mg/kg）分別于造模后半小時和造模前半小時腹腔內注射。Sham組和TBI組腹腔內注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.3 標本處理 小鼠造模后24 h取小鼠右肺上葉做干濕比，右肺下葉用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，小鼠左肺組織用于免疫蛋白檢測。取小鼠肺泡灌洗液用于炎癥因子檢測。

1.2.4 肺組織HE染色 取小鼠右下肺組織，4%多聚甲醛固定24 h后制備成石蠟切片后行HE染色。在×200放大倍數下，隨機取3個視野進行觀察，評分由2名實驗員通過雙盲的方法進行評估。評分細則由4個相對獨立的方面：肺泡腔充血、血管出血、炎性細胞浸潤情況及肺泡壁厚度。0分：代表正常肺組織；1分：代表輕微損傷，損傷程度＜25%；2分：代表中度損傷，損傷程度25%～50%；3分：代表重度損傷，損傷程度50%以上至75%；4分：代表極重度損傷，損傷程度＞75%。通過累加各指標得分為TBIALI總得分，取3個視野的平均值。

1.2.5 肺組織干濕比測定 采用眼科剪剪取右肺上葉一小塊新鮮肺組織，將其置于體重秤進行濕重稱量。將組織置于65℃烤箱中烘干，等待24 h，肺組織重量不再改變時記錄此時干重。肺組織干濕比重采用濕重/干重來表示，反應肺部水腫情況。

1.2.6 肺泡灌洗液處理 麻醉下仰臥位固定小鼠，采用眼科剪及蚊式直鉗小心游離氣管周圍組織后充分暴露小鼠氣管。用5ml注射器針頭去尖頭后在甲狀軟骨上方進行氣管插管，并用縫線將其固定。1ml注射器每次灌注1ml無菌PBS并重復3次，確保回吸率達到90%以上。將收集到的肺泡灌洗液進行離心1 000 r/min，5 min；其余上清液－80℃保存。用ELISA法測支氣管肺泡灌洗液上清中腫瘤壞死因子（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-10（IL-10）炎癥指標。ELISA試劑盒TNF-、IL-1及IL-10均購自美國Ebioscience。

1.2.7 肺組織相關蛋白測定 提取左肺組織蛋白，置－80℃保存。BCA法測定蛋白濃度，取總量50g蛋白進行上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳，電泳后轉至PVDF膜，封閉。隨后條帶置于TBST液中清洗3次，轉移至一抗抗體孵育盒中，4℃搖床孵育至少8 h以上。一抗濃度：轉錄因子p-NFAT（美國Invitrogen PA5-38301 1∶1 000）、血管內皮細胞間黏附分子（ICAM-1，美國Abcam AB179707 1∶1 000）及ACTIN（美 國Abcam AB8227 1∶2 000）。一抗孵育結束后，將條帶轉移至TBST中清洗3次，搖床上緩慢搖動，10 min/次。常溫孵育二抗2h后采用ECL法進行曝光。曝光后的條帶采用Image J軟件進行分析。

1.3 統計分析 數據采用SPSS23.0軟件統計分析，計量數據以均數±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用Turkey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對肺損傷病理組織學的影響 Sham組呈現了正常的肺組織表現；小鼠TBI造模后，肺組織出現了典型的炎癥病理反應，表現為中性粒細胞浸潤聚集，肺泡壁增厚，肺泡腔出血及肺組織間隙水腫等。在TBI+Glu組，谷氨酸進一步激活NMDAR后，肺損傷積分較單純TBI組更高（t=6.72，P＜0.05）。使用NMDAR阻斷劑MK-801后，小鼠TBI后的肺損傷明顯減輕，與Sham組差異無統計學差異（t=1.34，P＞0.05）。見封二彩圖1～2。

2.2 NMDAR的激活對肺組織干濕比影響 TBI小鼠造模后肺組織干濕比較Sham組明顯增加（t=6.14，P＜0.05），TBI+Glu組干濕比較TBI組進一步增加（t=2.59，P＜0.05）；使用MK-801的TBI小鼠干濕比較TBI組發生下降，與Sham組差異無統計學意義（t=1.45，P＞0.05）。見封二彩圖3。

2.3 肺組織中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10的變化 TBI組TNF-、IL-1及IL-10水平均高于Sham組（t≥4.28，均P＜0.05）。TBI+Glu組小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平均高于TBI組（t≥2.48，均P＜0.05）。TBI+MK-801組小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平與Sham組差異無統計學意義（t≤1.85，均P＞0.05）。見表1。

表1 肺組織中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10的變化（=10）pg/ml

2.4 肺組織中p-NFAT及ICAM-1蛋白變化 免疫蛋白學結果顯示，TBI組p-NFAT表達較Sham組下降，但ICAM-1表達量增加（t=4.11、4.51，均P＜0.05）。TBI+Glu組小鼠p-NFAT較TBI組下降，ICAM-1表達量卻增加（t=7.00、4.81，均P＜0.05）。TBI+MK-801組小鼠2種蛋白表達與Sham組差異均無統計學意義（t≤0.48，均P＞0.05）。見封二彩圖4。

3 討論

本研究結果顯示，TBI后小鼠可發生TBI-ALI，表現為造模后小鼠肺組織干濕比、肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達增加，肺組織病理損傷加重。注射谷氨酸后肺損傷較單純TBI組加重，而MK-801的使用則減輕了肺損傷的發生。此外，通過蛋白檢測肺組織中p-NFAT以及ICAM-1的改變，證明NMDAR加劇肺損傷過程與激活內皮細胞中NFAT信號通路相關。

TBI-ALI發生的機制多種多樣，其中爆破理論以及滲透性損傷理論被廣泛接受[7]。全身炎癥系統反應在TBI-ALI中發揮著重要作用，TBI可通過增加顱內炎癥因子的釋放入血到達外周器官引起損傷，又可通過促進神經遞質的傳遞到達靶器官，引起靶器官內炎癥因子的表達[8]。本實驗采用控制性皮層損傷構建小鼠TBI模型，通過檢測肺組織干濕比改變，BALF液中炎癥因子表達及肺組織HE染色，發現TBI組較Sham組干濕比增加，且炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達也上升。此外，TBI組小鼠肺組織HE染色發現肺泡間隔炎癥細胞浸潤，出血和水腫較Sham組嚴重。以上結果表明TBI模型建立，并成功誘導了TBI-ALI的發生，且其與炎癥反應的發生密切相關。

NMDAR作為一種谷氨酸離子型受體，不僅存在于神經系統中，在腎、肺、胰島 細胞以及血管等組織中均有表達[9]。研究發現，血液中谷氨酸水平與TBI-ALI的嚴重程度密切相關[10]。本研究結果發現，TBI+Glu組肺組織損傷較單純TBI組發生明顯的加重，表現為干濕比的增加，炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達上升，病理組織學評分的增高。而予抑制劑MK-801后，通過阻斷NMDAR在肺組中的作用，TBI組小鼠肺組織較單純TBI組減輕，與Sham組差異無統計學意義（P＞0.05）。進一步闡明了NMDAR在TBI-ALI模型中的興奮性作用，而阻斷NMDAR則可抑制炎癥因子的產生，從而對肺損傷起到保護作用。

轉錄因子NFAT首次在激活的T細胞中被發現，以磷酸化的形式存在于靜息狀態下，而當鈣調蛋白磷酸酯酶Calcineurin和NFAT激酶結合時，NFAT的磷酸化狀態改變并被激活，隨即入核促進下游炎癥基因的表達[11]。NFAT介導的炎癥信號通路與肺損傷有著密切聯系，NMDAR是NFAT的重要上游調節機制，兩者通過Ca2+信號傳遞樞紐，共同參與神經細胞的活性調節[12]。基于以上研究結果，本實驗對NFAT在TBI-ALI發生過程中的作用進行探究。結果顯示，TBI組及TBI+Glu組p-NFAT較Sham組發生了下降，其中以TBI+Glu組下降更明顯，提示NFAT轉錄因子在TBI組以及TBI+Glu組中被激活。ICAM-1在TBI組及TBI+Glu組表達較Sham組增加，其中TBI+Glu組增加更多。可見內皮細胞損傷較Sham組嚴重。在TBI+MK-801組，兩種蛋白與Sham組表達差異均無統計學意義（均P＞0.05），表明炎癥反應在使用NMDAR抑制劑MK-801后被抑制且內皮細胞得到了保護。進一步證明NMDAR的激活加劇了TBI-ALI的發生，且此過程可能與內皮細胞中NFAT被激活產生炎癥因子相關。

綜上所述，本研究發現了TBI-ALI損傷過程中的新機制，即NMDAR可激活內皮細胞中NFAT，使其促進大量炎癥因子的表達從而介導肺損傷的發生。因此，有效阻斷NMDAR在TBI-ALI產生過程中的作用，可減少炎癥因子的產生，盡早避免肺損傷的發生。