堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)的多態(tài)性

常 偉，丁明翠，王 威，*

(1．平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院疾控中心，河南平頂山 467002；2．鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室，河南 鄭州 450001)

細(xì)胞周期蛋白H(cyclin H，CCNH)是細(xì)胞周期蛋白大家族的一名成員，普遍存在于真核細(xì)胞中，其基因位于染色體5q14.3。CCNH可以催化周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)等多種CDK活化，并與周期蛋白依賴性激酶7(cyclindependent kinases 7，CDK7)共同對(duì)細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行合理調(diào)控，從而影響細(xì)胞的增殖。CCNH可以與CDK7、輔助蛋白(menage a trois 1，MAT1)組成CDK7/CCNH/MAT1三聚體復(fù)合物[1]，即人類的細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CAK)。CAK可以使P53、RNA聚合酶2(RNA polymerase 2，RNA2)、甾體激素受體等磷酸化，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和DNA的損傷修復(fù)，促使細(xì)胞分裂增殖，最終調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。從功能而言，CCNH是CAK的調(diào)節(jié)亞基，也是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的關(guān)鍵蛋白之一。細(xì)胞周期調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有研究表明，CCNH基因rs3093816位點(diǎn)與口腔癌的發(fā)病密切相關(guān)[2]；也有研究發(fā)現(xiàn)，CCNHVal270Ala(rs2230641)與高分化甲狀腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，雜合型和突變型基因型頻率越高，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越高[3]。越來(lái)越多的研究表明，CCNH基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌[4]、骨惡性腫瘤[5]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

目前對(duì)于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的檢測(cè)有很多方法，包括動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)[6]、熒光標(biāo)記探針(fluorescently labeled probes)技術(shù)[7]、和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(polymerase chain reaction-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[8]等。盡管上述方法各有其自身的優(yōu)勢(shì)，但是由于實(shí)驗(yàn)方法復(fù)雜，儀器設(shè)備比較昂貴，使它們的應(yīng)用受到了限制。其中，PCR-RFLP技術(shù)因其高靈敏度和可靠性而廣泛應(yīng)用于人類基因多態(tài)的檢測(cè)。然而，PCR-RFLP技術(shù)不適合高通量篩選，目前仍面臨著實(shí)用性的挑戰(zhàn)。通過(guò)查詢NEB網(wǎng)站(http://www.neb-china.com/)可知，CCNH基因rs3093816位點(diǎn)沒有相應(yīng)的內(nèi)切酶可以識(shí)別，在本研究中，我們采用一種改進(jìn)的PCR-RFLP法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)。應(yīng)用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)(creat restriction site，CRS)原理[9]，再結(jié)合PCR-RFLP方法設(shè)計(jì)引物，選擇廉價(jià)的內(nèi)切酶CviQ I，對(duì)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，本研究設(shè)計(jì)了堿基錯(cuò)配PCR長(zhǎng)引物和堿基錯(cuò)配相對(duì)短的PCR引物，比較分析堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物是否更快速經(jīng)濟(jì)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采集某企業(yè)160名職工體檢的健康人群外周血，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA后進(jìn)行CCNH基因型的檢測(cè)。參與本研究的研究對(duì)象均簽署了知情同意書。本研究已獲得鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會(huì)審批(ZZUIRB2021-80)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑DNA提取試劑盒，購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；1×PCR mix購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶CviQI購(gòu)于Thermo Scientific公司；引物和瓊脂糖購(gòu)于生工生物工程上海股份有限公司。

1.2.2 儀器9600型PCR儀購(gòu)于PE公司；微型電泳槽購(gòu)于Phamacia Biotech，EPS1000；GelDoc2000凝膠成像儀購(gòu)于Bio-Rad公司。

1.3 方法原理

創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)PCR-RFLP(creat restriction site-PCR-RFLP，CRS-PCR-RFLP)是根據(jù)引物堿基錯(cuò)配技術(shù)設(shè)計(jì)的檢測(cè)堿基突變的方法。其原理是根據(jù)單堿基突變位點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計(jì)引物，其中一條引物根據(jù)突變位點(diǎn)臨近序列設(shè)計(jì)，人為引入錯(cuò)配堿基，使得引物3′端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn)，然后應(yīng)用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。

1.4 序列查找及引物設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找CCNH基因及其SNP信息，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)確定CCNH基因rs3093816位點(diǎn)堿基變異信息，利用Primer Premier 5.0軟件分析內(nèi)切酶識(shí)別情況，通過(guò)創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)的方法引入新的酶切位點(diǎn)來(lái)識(shí)別變異。

1.4.1 序列搜索與多態(tài)位點(diǎn)確定結(jié)合網(wǎng)站信息及有關(guān)文獻(xiàn)可確定CCNH基因rs3093816位點(diǎn)為C/T多態(tài)，位于第5號(hào)染色體，在基因組中的位置為87401570。

1.4.2 序列分析與引物設(shè)計(jì)經(jīng)序列分析可知C/T多態(tài)沒有相應(yīng)的內(nèi)切酶可以識(shí)別，如通過(guò)堿基錯(cuò)配PCR將多態(tài)位點(diǎn)前第3位堿基T替換為G，則該多態(tài)可由內(nèi)切酶RsaI及其同工酶CviQ I識(shí)別，本研究選擇較便宜的CviQ I內(nèi)切酶，即C等位基因可被CviQ I內(nèi)切酶及其同工酶RsaI識(shí)別并切開，而T等位基因不能被切開。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述分析應(yīng)用CRS-PCR-RFLP原理設(shè)計(jì)引物。首先利用Primer Premier 5.0軟件分析內(nèi)切酶識(shí)別情況，根據(jù)序列情況確定上游引物的位置與長(zhǎng)度，然后搜索合適的下游引物，選定引物見表1。

表1 長(zhǎng)引物和短引物基本信息

1.5 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定

取50 ng的基因組DNA 1μL，上下游引物各0.3μL(均為0.2μmol/L)，1×PCRmix 7.5μL(包括4種dNTP混合物、Taq DNA聚合酶和鎂離子)，與雙蒸水組成15μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為首先94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，Tm(短引物取46℃，長(zhǎng)引物取58℃)下退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。取PCR產(chǎn)物10μL，加入10 U內(nèi)切酶和2.5μL 10×酶切緩沖液和ddH2O組成25μL反應(yīng)體系，37℃水浴中酶切過(guò)夜，電泳35 min和55 min后，用凝膠成像儀觀察成像。

1.6 測(cè)序驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物測(cè)序采用sanger雙脫氧鏈終止法，委托生工生物工程上海股份有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 CCNH基因rs3093816位點(diǎn)多態(tài)分布與Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

經(jīng)知情同意后采集某企業(yè)160名職工體檢的健康人群外周血，提取基因組DNA后進(jìn)行CCNH基因rs3093816位點(diǎn)基因型的檢測(cè)。CCNH基因rs3093816位點(diǎn)野生型TT 59例(36.88%)，雜合型CT 76例(47.50%)，突變型CC 25例(15.63%)。該基因多態(tài)分布經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，P=0.949，符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明所選取的樣本具有代表性。

2.2 基因型的判斷

CCNH基因rs3093816位點(diǎn)長(zhǎng)引物擴(kuò)增后總長(zhǎng)度為164 bp，經(jīng)CviQ I酶切后可出現(xiàn)164、126、38 bp等3種片段(其中38 bp由于分子量較小，條帶彌散，在電泳圖中未顯示)。酶切后基因型分別為：突變型CC為164、38 bp，雜合型CT為164、126、38 bp，野生型TT為164 bp。CCNH位點(diǎn)短引物擴(kuò)增后總長(zhǎng)度為259 bp，經(jīng)CviQ I酶切后可出現(xiàn)259、240、19 bp等3種片段(其中19 bp由于分子量較小，條帶彌散，在電泳圖中未顯示)。酶切后基因型分別為：突變型CC為240、19 bp，雜合型CT為259、240、19 bp，野生型TT為259 bp。酶切圖譜見圖1，表2。

表2 堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物和堿基錯(cuò)配相對(duì)短PCR引物法比較

圖1 CCNH基因rs3093816位點(diǎn)PCR產(chǎn)物經(jīng)Cvi Q I內(nèi)切酶酶切后的電泳圖

使用堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物和堿基錯(cuò)配相對(duì)短PCR引物法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)。使用3%的瓊脂糖凝膠電泳35 min后，長(zhǎng)引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶完全分開，清晰可分辨；短引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶尚未完全區(qū)分開，特別是泳道4對(duì)應(yīng)的雜合型基因型尚不能分辨。直到電泳時(shí)間達(dá)到55 min時(shí)，短引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶才完全分開，清晰可分辨。

2.3 CCNH基因rs3093816位點(diǎn)結(jié)果鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)出現(xiàn)野生型TT、突變型CC和雜合型CT 3種基因型。對(duì)上述3種基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，CCNH基因rs3093816位點(diǎn)3種類型的基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果跟預(yù)期結(jié)果完全一致。測(cè)序結(jié)果見圖2。其中，方框內(nèi)的字母對(duì)應(yīng)多態(tài)堿基，單下劃線的堿基為錯(cuò)配堿基，從而與前面的堿基共同形成酶切位點(diǎn)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 CCNH基因rs3093816位點(diǎn)測(cè)序分析結(jié)果

3 討論

經(jīng)序列分析可知CCNH基因rs3093816位點(diǎn)沒有相應(yīng)的內(nèi)切酶可以識(shí)別，本研究通過(guò)創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)PCR-RFLP方法在CCNH基因rs3093816位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物中引入新的酶切位點(diǎn)，成功建立了堿基錯(cuò)配PCR引物法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)。常規(guī)設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度為15～30 bp，本研究設(shè)計(jì)的長(zhǎng)引物長(zhǎng)度為40 bp，兩個(gè)片段長(zhǎng)度差異約占總長(zhǎng)引物長(zhǎng)度的23%，所占比例高于短引物(8%)。據(jù)我們所知，PCR-RFLP方法中幾乎沒有使用過(guò)長(zhǎng)PCR引物。本研究同時(shí)設(shè)計(jì)了堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物和堿基錯(cuò)配相對(duì)短PCR引物，比較分析堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物是否更快速經(jīng)濟(jì)。與短引物法相比，長(zhǎng)引物占擴(kuò)增總片段的比例越大，酶切產(chǎn)物越容易區(qū)分，凝膠電泳需要的時(shí)間越短。此外，長(zhǎng)引物法的Tm值較高，特異性較好。

通過(guò)查詢PubMed SNP數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，本研究測(cè)得的正常人群的CCNH基因rs3093816位點(diǎn)多態(tài)性分布與在亞洲人群中分布一致。有研究顯示，CCNH基因rs3093816位點(diǎn)與口腔癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)，且GG基因型攜帶者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高兩倍[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)T等位基因攜帶者發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)升高[11]。我們可以通過(guò)檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)篩選易感人群，因此，SNP的檢測(cè)也變得越來(lái)越重要。SNP常用的檢測(cè)方法有DNA測(cè)序[12]，TaqMan分析[12]，熒光標(biāo)記探針技術(shù)[13]，PCR-RFLP[14]等。DNA測(cè)序是一種精確的基因分型方法，但成本較高。TaqMan探針技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是它不需要PCR分離或洗脫等后處理過(guò)程，從而提高檢出率。但TaqMan探針熒光背景較高，且探針只有一個(gè)堿基的差異，結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；分子信標(biāo)被標(biāo)以不同顏色的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP的同時(shí)檢測(cè)。然而，適合熒光標(biāo)記的染料比較少，這大大限制了檢測(cè)通量[15]。

因?yàn)镻CR-RFLP容易掌握，且具有較高的靈敏度和可靠性，所以在SNP檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。本研究采用創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法成功建立了堿基錯(cuò)配長(zhǎng)引物法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物純度比較高，酶切結(jié)果也容易分辨，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。更加拓寬了該方法的應(yīng)用范圍，具有很大的靈活性和應(yīng)用前景，特別適用于基層單位的檢測(cè)。

綜上所述，我們成功建立了堿基錯(cuò)配長(zhǎng)PCR引物法檢測(cè)CCNH基因rs3093816位點(diǎn)，此方法具備簡(jiǎn)經(jīng)濟(jì)快速的特點(diǎn)，可廣泛用于大規(guī)模樣本分析。