CRP基因rs3093068位點多態性與缺血性卒中危險因素及卒中結局的相關性研究

石延楓，程絲，許喆，劉陽，李昊，王擁軍，3

CRP升高作為全身炎癥和內皮炎癥反應的敏感標志物，是卒中發生和發展的獨立危險因素[1-5]。研究CRP基因相關的遺傳變異與卒中危險因素及卒中結局的相關性，有助于了解卒中進展并探索潛在的治療靶點[6-9]。維生素干預預防卒中（vitamin intervention for stroke prevention，VISP）臨床試驗隊列分析發現，rs3093068位點與外周血CRP水平以及卒中復發相關[8]。然而，該研究納入的主要是非裔美國人，未在中國人群中研究，且樣本量僅為2100例。此外，rs3093068位點和卒中相關危險因素的相關性以及與卒中結局（卒中復發、聯合血管事件和不良功能結局）的系統性研究尚缺乏報道。本研究基于中國國家卒中登記Ⅲ（China national stroke registry-Ⅲ，CNSR-Ⅲ）隊列遺傳亞組中的7773例首次發生缺血性卒中或TIA的患者，系統性分析了rs3093068位點不同基因型與已知的缺血性卒中危險因素以及各亞型結局的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究基于全國多中心前瞻性CNSR-Ⅲ隊列[10-11]，連續納入2015年8月-2018年3月入組的14 146例缺血性卒中患者和1020例TIA患者。CNSR-Ⅲ入組標準：年齡≥18歲；缺血性卒中或TIA；發病至入組時間≤7 d。其中，12 603例患者參與了預先設計的遺傳亞組研究。入組患者覆蓋全國22個省和4個直轄市的201所醫院。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得首都醫科大學附屬北京天壇醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：KY 2015-001-01）。

1.2 納入排除標準 納入標準：①CNSR-Ⅲ中參與了預先設計的遺傳亞組研究的患者；②既往無缺血性卒中病史；③提供了基線血樣并且提取的DNA含量足夠。本研究排除了病因學分型為其他確定病因型的卒中患者。

1.3 資料收集與定義 通過CNSR-Ⅲ臨床數據庫提取患者基線信息：①人口特征信息，包括年齡、性別、BMI；②既往史，包括吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、血脂異常、心房顫動、冠心?。虎郯l病診斷相關信息，包括卒中發病類型、入院時NIHSS、卒中病因學分類（causative classification of stroke，CCS）系統亞型[12]；④血液標志物，包括hs-CRP、LDL-C。其中hs-CRP及LDL-C檢測為中心化統一檢測。

重度飲酒者：每日≥2倍標準飲酒量。高血壓：收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg以及使用任何降壓藥物或患者自述的高血壓病史；糖尿?。喝朐簳r或在住院期間空腹血糖≥7.0 mmol/L，或患者自述病史以及醫師診斷的糖尿病，或患者有使用降血糖藥物史；血脂異常、心房顫動和冠心病定義為患者自述或醫師診斷疾病史，或住院期間被診斷此疾病。

使用C C S系統對患者進行卒中病因學亞型分型，包括大動脈粥樣硬化型（largeartery atherosclerotic，LAA）、心源性栓塞型（cardioembolic，CE）、小動脈閉塞型（small a r ter y occ lusion，SAO）、其他確定病因型（other common causes，OC）和病因未明型（undetermined causes，UC）。

1.4 卒中隨訪結局 CNSR-Ⅲ隊列采用中心化隨訪，由首都醫科大學附屬北京天壇醫院隨訪中心經過統一規范化培訓后的隨訪人員在患者發病后1年進行隨訪（發病3個月和1年時采用面對面隨訪，發病6個月時采用電話隨訪）。從患者的就診醫院采集卒中復發和聯合血管事件發生的信息，由獨立終點判斷委員會判斷未住院患者的疑似事件。卒中復發定義為1年隨訪期間，患者再次發生新的缺血性卒中或出血性卒中。聯合血管事件包括缺血性卒中、出血性卒中、心肌梗死和1年隨訪期間的血管性死亡。不良功能結局定義為1年隨訪時mRS≥3分。

1.5 基因型檢測 使用競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）對rs3093068位點進行基因型檢測[13]。同時，為保證基因型檢測的準確性，隨機選擇10例患者的DNA，采用Sanger測序技術同時檢測rs3093068位點，兩種方法間的一致性＞95%。

2 結果

2.1 患者篩選 CNSR-Ⅲ隊列共納入15 166例患者，其中12 603例參與了遺傳亞組的研究，10 227例患者采用KASP進行基因型檢測，排除100例rs3093068位點基因型檢測失敗以及2292例有缺血性卒中病史的患者，再將7835例患者中CCS分型為OC亞型的62例患者排除，最終納入分析的患者共7773例（圖1）。

CNSR-Ⅲ-中國國家卒中登記Ⅲ；KASP-競爭性等位基因特異性PCR；LAA-大動脈粥樣硬化型；CE-心源性栓塞型；SAO-小動脈閉塞型；OC-其他確定病因型；UC-病因未明型。

2.2 rs3093068位點基因型攜帶者基線資料與卒中危險因素分析 rs3093068位點GG、GC和CC基因型攜帶者的頻數和比例分別為5334例（68.62%）、2196例（28.25%）和243例（3.13%）。rs3093068位點GG、GC、CC基因型攜帶者的hs-CRP中位水平分別為1.53（0.75～4.07）mg/L、2.04（1.00～5.14）mg/L、2.75（1.30～6.62）mg/L，不同基因型患者血液hs-CRP水平差異有統計學意義（P＜0.001），其余基線指標（性別、年齡、BMI、目前吸煙者比例、重度飲酒者比例、入院時NIHSS＞3分者比例、相關病史比例及LDL-C水平）之間的差異均未達到統計學意義。此外，統計不同基因型在卒中亞型分析中的差異發現，各亞型中GG、GC和CC基因型攜帶者的比例差異無統計學意義（表1）。

表1 rs3093068位點不同基因型患者的基線特征

2.3 rs3093068位點基因型在不同卒中結局中的分布 該位點的次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）為17.2%，經χ2檢驗，該位點符合HWE檢驗（χ2=0.857，P=0.362）。對該位點在不同結局中的分布統計發現，GG、GC和CC基因型在1年隨訪卒中復發、聯合血管事件以及不良功能結局事件中的分布差異無統計學意義（表2）。

表2 rs3093068位點基因型在不同結局分組中的分布情況

2.4 rs3093068位點基因多態性與卒中結局的關系 在加性、顯性及隱性3種遺傳模型中，未發現rs3093068位點基因多態性與卒中復發、聯合血管事件、不良功能結局3種卒中結局的相關性；在校正年齡、性別、心房顫動、入院NIHSS和聯合血管事件后，rs3093068位點基因多態性與3種卒中結局仍不相關（表3）。

表3 rs3093068位點基因多態性對卒中結局發生的影響

2.5 rs3093068位點基因多態性與不同亞型卒中結局的關系 按照CCS分型，對rs3093068位點基因多態性與卒中不同亞型的結局進行分層分析。結果發現，在加性和隱性模型下，經多因素校正后，CC基因型與病因未明型卒中的不良功能結局相關，CC基因型攜帶者不良功能結局的風險分別為2.19（95%CI1.01～4.41）和2.29（95%CI1.06～4.57）；未發現該位點與其他亞型預后的相關性（表4）。

表4 rs3093068位點基因多態性對不同亞型卒中結局發生的影響

3 討論

本研究系統地分析了CRP基因rs3093068位點基因多態性與缺血性卒中危險因素以及不同亞型結局之間的相關性。rs3093068位點（g.159711574 C＞G）位于CRP基因間區[14]，曾被報道與缺血性卒中的發生有關，但未表明是否與卒中的進展相關，本研究發現該位點的次要等位基因與病因未明型卒中的不良功能結局相關。

既往研究發現rs3093068位點與缺血性卒中的發生風險相關。研究發現，rs3093068、rs16842599和rs11265260位點和缺血性卒中的發生和復發相關[8]，但該研究未對卒中亞型進行分析且未分析患者的不良心血管事件以及不良功能結局等預后。對缺血性卒中相關危險因素的分析發現，rs3093068位點不同基因型患者血液中hs-CRP水平有明顯差異，證實了在中國人群中該位點和hs-CRP水平的關聯，也提示該位點與卒中結局關聯的機制可能與其介導的炎癥相關通路有關[15-20]。den Hertog等[21]的研究發現，CRP基因上3個位點（包括rs1130864：C＞T，rs1205：C＞T和rs3093068：C＞G）的CRP單倍型中的CCG單倍型與缺血性卒中患者血液中CRP水平相關。Reitz等[22]關于CRP單倍型和血清CRP水平以及老年人腦小血管病風險的相關研究發現，rs3093068位點的CC、CG和GG基因型頻率分別為87.6%、9.1%和0.9%，其主要基因型為CC，與本研究顯著不同；此外，該研究納入的1303例樣本主要來自荷蘭和德國，提示了不同種族該位點的不同；與血清CRP水平和腦小血管病的相關性分析發現，CCG單倍型與血清CRP和腦小血管病風險均無統計相關性。Ridker等[23]關于介導代謝綜合征通路基因上的多肽位點與妊娠糖尿病及其長期影響相關研究發現，rs3093068位點與血漿CRP水平顯著相關，并且發現CRP基因上多個單核苷酸多態性（single

nucleotide polymorphism，SNP）位點與調控糖尿病和早期動脈粥樣硬化形成相關的信號轉導途徑相關，提示該位點可能參與調節血脂相關基因，但本研究未發現其與LDL-C的相關性?？梢娔壳瓣P于rs3093068多態性與CRP水平及腦血管病的研究在不同人群中的結論不一致，這可能與不同地區、不同種族人群基因型分布的差異性有關。除hs-CRP因素外，本研究的rs3093068位點與患者BMI、高血壓、冠心病、糖尿病、LDL-C水平以及血脂異常均無一定關聯，表明該位點與卒中結局之間的關聯可能不是通過這些危險因素介導的。

本研究有助于病因未明型卒中預后的風險評估，對于理解遺傳因素在病因未明型卒中進展和預后中的作用及探索潛在的治療靶點有重要意義，提示了后續研究應關注rs3093068位點與危險因素相互作用的相關機制。本研究存在以下局限性：第一，本研究所發現的rs3093068位點與hs-CRP水平及病因未明型卒中不良功能結局的相關關系不能解釋其因果關系；第二，不同亞型卒中的結局可能由不同的遺傳和環境因素影響，本研究所發現的rs3093068位點與卒中結局關聯結果的具體機制尚需進一步探索；第三，本研究是基于CNSR-Ⅲ的子隊列研究，其中患者主要來自城市環境，可能不代表整個中國卒中患者群體。

【點睛】本研究系統分析了CRP基因rs3093068位點與卒中結局及危險因素的相關性，發現該位點與病因未明型卒中的不良功能結局之間存在相關性。