三陰型乳腺癌間質腫瘤浸潤淋巴細胞CD4、CD8、Foxp3和PD-L1表達的臨床病理意義

鐘戀君，王進京，鄭 洪

乳腺癌是全球女性中常見的惡性腫瘤之一，且腫瘤內部存在高度異質性，嚴重威脅著女性的生命健康[1-2]。三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中極具侵襲性的一種亞型，占所有浸潤性乳腺癌的10%～20%，具有侵襲性強，惡性程度高，易復發和轉移的特點，預后較差[3]。TNBC的主要生物學特征為缺乏ER、PR和HER-2的表達，有研究表明，TNBC中高密度間質腫瘤浸潤淋巴細胞(stromal tumor-infiltrating lymphocytes, sTILs)是獨立預后因素，并能夠延長TNBC患者的總生存期(overall survival, OS)[4]。在sTILs的不同亞群中，腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TILs-T)在乳腺中發揮主要的抗腫瘤活性，包括CD4+(輔助)和CD8+(細胞毒性)sTILs[5-6]。另外，有研究認為高水平的Foxp3+Tregs與不良預后有關[7-9]，然而并未達成共識。此外有研究表明，相比其他乳腺癌亞型，TNBC腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)中存在程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)高表達[10-11]，這為發現乳腺癌治療新靶點提供了依據。然而，目前針對CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs及PD-L1+sTILs在乳腺癌中的預后價值仍然存在爭議，需要進一步研究以充分了解其意義。本實驗旨在通過評估92例TNBC腫瘤區域內sTILs的浸潤密度，并采用免疫組化EnVision法檢測TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤密度及sTILs的PD-L1蛋白表達情況，探討TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤密度和sTILs中PD-L1表達與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集遵義醫科大學附屬醫院2015～2019年收治的具有完整臨床病理資料的女性TNBC標本92例，所有患者均未行放療或化療，且由兩位副高以上職稱病理醫師閱片后明確診斷。92例TNBC患者中位年齡45歲(26～75歲)，腫瘤中位直徑2.0 cm(1.0～7.0 cm)。組織學類型均為浸潤性導管癌，其中低級別癌(組織學分級Ⅰ+Ⅱ級)44例，高級別癌(組織學分級Ⅲ級)48例。有淋巴結轉移者22例；74例Ki-67增殖指數>20%。

1.2 方法對92例TNBC標本行免疫組化EnVision法染色。兔抗人CD4(SP35)、CD8(SP16)抗體及免疫組化EnVision法試劑盒均購自福州邁新公司，兔抗人Foxp3(10211R)抗體購自北京博奧森生物公司，兔抗人PD-L1(SP142)抗體購自上海羅氏診斷產品公司(Ventana檢測平臺)。以扁桃體組織作為陽性對照。染色步驟：標本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。二甲苯脫蠟，乙醇分級水化，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液修復，PBS沖洗，滴加一抗后-4 ℃恒溫箱中過夜，滴加山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗處理，DAB顯色。蘇木精對比染色，鹽酸乙醇分化、反藍，乙醇分級脫水，封固。

sTILs結果判定標準：根據國際TILs工作組建議，sTILs評分定義為單核炎性細胞占據腫瘤基質面積的百分比。(1)首先在低倍鏡下評估整張HE切片，觀察sTILs分布是否均勻；(2)若sTILs分布較均勻，隨機選取10個高倍鏡視野計數，取平均數；(3)若sTILs分布不均勻，排除分布最高和最低區域，隨機選取8個視野在高倍鏡下計數，取平均數。

PD-L1結果判定標準：首先觀察腫瘤細胞中免疫細胞(immunocyte, IC)的PD-L1染色情況，在腫瘤內和(或)腫瘤周圍間質中任何強度PD-L1染色的IC所占腫瘤區域面積的百分比≥1%定義為陽性。

CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs結果判定標準：(1)首先在低倍鏡下評估整張切片，觀察腫瘤基質陽性細胞分布是否均勻；(2)若分布較均勻，隨機選取5個高倍鏡視野計數陽性細胞個數，取平均數；(3)若分布不均勻，排除分布最高和最低區域，隨機選取3個視野在高倍鏡下計數陽性細胞個數，取平均數。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗(Chi-Square test)或Spearman秩相關性檢驗對分類變量進行相關性分析，應用Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風險回歸模型對TNBC預后相關因子進行單因素和多因素分析。采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 sTILs中PD-L1表達及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關系本組92例TNBC中，將sTILs浸潤密度以10%和50%為臨界值分為低密度組(≤10%)、中密度組(>10%，≤50%)和高密度組(>50%)(圖1)，并進行HE切片評估，其中sTILs中任何強度PD-L1染色的IC所占腫瘤區域面積的百分比≥1%確定為陽性(圖2A)，而CD4+(圖2B)、CD8+(圖2C)、Foxp3+(圖2D)sTILs均以各自中位值為臨界值進行分組將它們分為低密度組和高密度組。本實驗檢測得出：CD4+sTILs浸潤密度(6～242)個/HPF，中位值為38個/HPF；CD8+sTILs浸潤密度(8～298)個/HPF，中位值42個/HPF；Foxp3+sTILs浸潤密度(4～34)個/HPF，中位值8個/HPF。

圖1 TNBC中腫瘤細胞呈片狀或條索狀排列并浸潤周圍間質，其腫瘤細胞團周圍間質見數量不等的淋巴細胞浸潤：A.低密度sTILs(≤10%)；B.高密度sTILs(>50%) 圖2 TNBC中sTILs呈散在或彌漫分布在腫瘤細胞團的周圍間質中：A.PD-L1+sTILs的表達，EnVision兩步法；B.CD4+sTILs的表達，EnVision兩步法；C.CD8+sTILs的表達，EnVision兩步法；D.Foxp3+sTILs的表達，EnVision兩步法

2.1.1sTILs中PD-L1表達與TNBC臨床病理特征的關系 92例TNBC sTILs中PD-L1陽性20例，陰性72例。將實驗所得數據進行χ2檢驗和相關性分析發現：sTILs中PD-L1表達與TNBC組織學分級、sTILs浸潤密度顯著相關(P<0.05)，而與腫瘤直徑、淋巴結轉移、年齡無相關性(P>0.05，表1)。

表1 PD-L1與TNBC臨床病理特征的關系

2.1.2sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關系 sTILs與Ki-67增殖指數呈正相關(rs=0.334，P=0.001)，與組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移、年齡無相關性(P>0.05)。CD4+、CD8+sTILs均與腫瘤直徑呈負相關(rs=-0.261，P=0.012；rs=-0.287，P=0.006)，與Ki-67增殖指數呈正相關(rs=0.208，P=0.047；rs=0.286，P=0.006)，與sTILs呈正相關(rs=0.311，P=0.003；rs=0.368，P<0.05)，而與組織學分級、淋巴結的轉移及年齡無相關性(P>0.05)。Foxp3+sTILs與組織學分級呈正相關(rs=0.353，P=0.001)，與年齡呈負相關(rs=-0.227，P=0.030)，與患者腫瘤直徑、淋巴結轉移、Ki-67增殖指數及sTILs無相關性(P>0.05，表2)。

表2 sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關系

2.2 sTILs中PD-L1表達及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC患者預后的關系應用Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風險回歸模型對92例TNBC預后相關因子進行單因素和多因素分析。所有患者的治療方式相同，均為手術輔以相同藥物放、化療，92例TNBC患者均從明確診斷后進行隨訪，隨訪時間1～67個月，其中存活80例，死亡12例，平均隨訪時間31.54個月，其中42例(45.7%)隨訪時間不滿5年，包括出現終點事件(死亡)而終止的病例。PD-L1陽性組20例，其中存活15例，死亡5例，平均生存時間22.60個月；PD-L1陰性組72例，其中存活65例，死亡7例，平均生存時間33.84個月。Kaplan-Meier分析表明：sTILs中PD-L1表達與TNBC患者預后顯著相關，與PD-L1陰性患者相比，PD-L1陽性患者的OS更短(P=0.039，圖3A)；而淋巴結轉移也與較短的OS相關(P=0.012，圖3B)。Cox回歸分析顯示：sTILs中PD-L1表達和淋巴結轉移均是OS的獨立因素(P<0.05，表3)。sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs在患者預后中的差異無統計學意義(P>0.05，表3)，即與患者預后無相關性。

圖3 TNBC sTILs中PD-L1表達(A)、淋巴結轉移(B)與患者OS的關系

表3 TNBC患者OS的單變量和多變量分析

3 討論

TNBC具有高侵襲性和易復發的特點，一般預后較差，而傳統的手術治療輔以放、化療雖然能夠一定程度上提高患者術后的生活質量，但患者病死率仍無明顯下降。因此，尋找新的可靠的治療靶點有助于改善患者的預后及生存率。sTILs作為TNBC的獨立預后因素，可以通過其內部免疫亞群，包括CD4+和CD8+sTILs在乳腺癌中發揮主要的抗腫瘤活性，與此同時，研究發現TNBC中PD-L1高表達及Foxp3+Tregs高浸潤可能與患者的不良預后有關。然而，對于上述研究在乳腺癌中的預后價值仍然存在爭議。本實驗通過分析TNBC中sTILs的PD-L1蛋白表達及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤密度，探討sTILs及其免疫亞群與TNBC發生、發展的關系，從而進一步揭示腫瘤免疫逃逸的相關機制，為乳腺癌的免疫治療提供新的靶點和臨床依據。

乳腺癌TME中，sTILs在宿主對抗腫瘤免疫反應中發揮著重要作用。在一項關于淋巴結陽性乳腺癌的研究中發現高密度的sTILs與高水平的Ki-67相關[12]，另一項乳腺癌的研究亦獲得了同樣的結論[13]。本實驗發現TNBC中高密度的sTILs與高水平的Ki-67呈正相關，這與上述兩項研究結果相符合，作者推測sTILs浸潤密度的增高與乳腺癌腫瘤細胞的分化和增殖密切相關，這說明sTILs具有重要的抗腫瘤免疫作用。最近一項關于乳腺癌的研究[14]發現：CD8+sTILs與組織學分級及Ki-67增殖指數呈正相關。而本實驗發現CD4+、CD8+sTILs均與腫瘤直徑呈負相關，而與Ki-67增殖指數呈正相關。CD4+sTILs是一類輔助性T細胞，它可以激活腫瘤特異性CD8+sTILs增殖和記憶，而CD8+sTILs是機體發揮細胞免疫抗腫瘤反應的主要參與者。因此，根據本實驗結論可推測，處于高增殖活性的乳腺癌通過與CD8+sTILs相互作用，并使后者產生如γ干擾素等細胞因子，直接或間接促進和增強細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷作用，以實現抗腫瘤免疫反應。而另外一項對88例TNBC活檢標本的研究[15]發現CD8+sTILs與臨床病理特征無相關性，其原因可能是標本的來源形式(活檢標本或手術標本)及儲存時間差異等造成實驗結果的不同，有待進一步驗證。Foxp3+sTILs是一種重要的免疫抑制細胞，它可以通過干擾腫瘤細胞的抗原提呈，抑制T細胞殺傷功能，幫助腫瘤細胞實現免疫逃逸。Goto等[16]在一項針對TNBC的研究中發現：高水平的Foxp3+sTILs與組織學分級呈正相關，即腫瘤分化越差Foxp3+sTILs浸潤越高，這與本實驗結果相一致。這提示Foxp3+sTILs可能通過釋放TGF-β和IL-10等因子直接或間接抑制腫瘤特異性T細胞發揮免疫抑制功能，促進腫瘤的免疫逃逸，這可能是乳腺癌免疫治療新的潛在靶點。然而，Glajcar等[17]的研究認為高水平的Foxp3+sTILs與Ki-67增殖指數、腫瘤大小及淋巴結轉移相關，這可能與實驗標本的類型選擇、收集標本數量及免疫組化抗體類型不同相關，有待進一步探索。PD-1/PD-L1是重要的免疫檢查點，它可以調節腫瘤細胞和sTILs的功能。盡管關于PD-L1在乳腺癌的研究取得了一定成果，但目前關于sTILs中PD-L1表達及其在乳腺癌中的預后意義仍未得到充分研究。先前的研究發現PD-L1表達與淋巴結轉移、Ki-67增殖指數、組織學分級有關[18]。亦有研究表明，PD-L1在sTILs中的表達與患者的不良預后相關[19-20]。本實驗使用抗體為PD-L1(SP142)，檢測結果顯示sTILs中PD-L1表達與組織學分級相關，同時PD-L1陽性患者具有更短的OS，這表明TNBC腫瘤細胞的分化越差，sTILs中PD-L1表達越高，患者的預后越差。

以往大多數實驗表明，高水平的sTILs與TNBC患者預后良好相關，即高密度sTILs的TNBC患者具有較長的OS，然而本實驗卻未能證明該觀點，這可能與本組選取的TNBC樣本量有限有關，而標本的類型及儲存時間、抗體的差異等也可能對實驗結果造成影響，有待后續擴充樣本數據進行論證。同時本實驗發現sTILs中PD-L1表達與TNBC的不良預后相關，sTILs中PD-L1陽性患者較PD-L1陰性患者具有較短的OS。根據本實驗結果分析得出，PD-L1高表達可能是TILs介導的抗腫瘤免疫反應的結果，腫瘤細胞通過表達PD-L1與免疫細胞的PD-1結合，抑制免疫細胞的腫瘤殺傷作用，同時也可能通過分泌腫瘤細胞因子直接或間接促進腫瘤的免疫逃逸。有研究認為PD-L1表達與良好的預后之間存在正相關，還有研究發現PD-L1表達與預后之間呈負相關或無相關性[21-22]，這可能是由于不同抗體的敏感性和特異性不同，或腫瘤樣本的類型和儲存時間以及腫瘤自身異質性等因素造成實驗結果的差異。雖然PD-L1表達對患者預后的意義仍有爭議，但本實驗結果顯示PD-L1表達與TNBC的不良預后相關，這更加說明了免疫檢查點作用機制在腫瘤進展中的重要作用。本組接下來仍需要納入更多有關TNBC的臨床實驗數據，并盡可能的排除干擾因素，以補充TNBC中PD-L1的生存數據對上述結果進行驗證。同時，本實驗還發現TNBC中淋巴結轉移是OS的獨立預后因素，淋巴結轉移陽性患者較陰性患者具有更短的OS。有研究認為，TNBC中CD8+sTILs可能與患者良好的預后相關，這進一步說明了CD8+sTILs在TNBC中發揮著重要的抗腫瘤免疫反應，同時CD4+sTILs作為輔助性T細胞可以激活腫瘤特異性CD8+sTILs的記憶和增殖，它們共同促進腫瘤細胞的凋亡來實現抗腫瘤免疫反應。然而，本實驗未能論證以上觀點，有待進一步討論。最后，本實驗通過分析得出Foxp3+sTILs與TNBC患者的預后無相關性，與文獻報道結果[5,23]不符，這可能與本組標本及抗體選擇的差異有關，需后續進一步研究和分析。

綜上所述，sTILs中PD-L1表達及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs浸潤程度可能與TNBC的發生、發展密切相關。sTILs中PD-L1高表達提示TNBC患者預后不良，這表明PD-L1可作為TNBC的治療靶點及預后生物標志物，而由于樣本量及抗體選擇的差異，sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs對于患者的預后作用仍有待進一步的研究證實。若能闡明sTILs及其免疫亞群在腫瘤免疫逃逸的相關機制，必將為乳腺癌的免疫治療提供重大的理論及臨床依據。