免疫組化雙重染色技術(shù)在非小細胞肺癌PD-L1檢測中的應(yīng)用

徐 瑤，王滿香，王明偉，張楊鴿齡，金 蘇，方 娜，岳君秋

位居惡性腫瘤的第2位(11.4%)，并且是癌癥死亡的主要原因(18%)[1]。針對PD-1/PD-L1的多種抑制劑已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)及我國國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)批準，用于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的免疫治療。其中Pembrolizumab成為PD-L1高表達患者的一線治療用藥，低表達患者可采用免疫聯(lián)合化療，因此PD-L1表達水平對指導(dǎo)NSCLC的治療決策具有重要意義[2-4]。由于PD-L1不僅表達于腫瘤細胞，還表達于免疫細胞、壞死細胞甚至正常細胞，給準確評估腫瘤比例評分(tumor proportion score, TPS)造成困難。因此，本實驗擬建立PD-L1/TTF-1或PD-L1/p40免疫組化雙重染色技術(shù)，以準確評估肺腺癌和鱗狀細胞癌細胞中PD-L1的表達水平，更好地為臨床治療決策提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018～2020年湖北省腫瘤醫(yī)院病理科診斷的NSCLC樣本：肺腺癌25例(活檢12例，手術(shù)切除13例)，肺鱗狀細胞癌25例(活檢5例，手術(shù)切除20例)。其中22例(14例腺癌和8例鱗狀細胞癌)既往已行PD-L1檢測，設(shè)為檢驗雙重染色可行性及優(yōu)化實驗條件的陽性對照病例。排除標準：腫瘤細胞數(shù)<100個；TTF-1、p40陰性或非均質(zhì)性表達的腺癌/鱗狀細胞癌病例。

1.2 主要試劑及儀器TTF-1(兔單抗EPR-5955，稀釋比1 ∶300，Abcam公司)，p40(兔多抗ZA-0483，稀釋比1 ∶300，北京中杉金橋公司)，PD-L1(鼠單抗22C3，稀釋比1 ∶50，Dako公司)，DAB快紅雙重染色檢測試劑盒(DS0003，含酶標羊抗兔二抗，北京中杉金橋公司)、酶標羊抗鼠二抗(IB000087，北京中杉金橋公司)。對照組PD-L1單染采用獲批的PD-L1伴隨診斷試劑盒(同上)，染色平臺為Dako Link 48全自動免疫組化染色儀，染色流程嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚切片，行HE染色及免疫組化雙重染色。免疫組化雙重染色流程：(1)全自動免疫組化預(yù)處理儀(PT-Link，Dako公司)修復(fù)；(2)加入第一種一抗PD-L1，37 ℃孵育1 h；加入Linker，37 ℃ 30 min；加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色4 min，拍照；50 ℃水浴阻斷1 h，加入第二種一抗TTF-1或p40，37 ℃孵育1 h，加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育30 min，快紅顯色5 min；(3)蘇木精復(fù)染，氨水返藍，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明、封固。

1.4 結(jié)果判讀PD-L1結(jié)果判讀由資深病理醫(yī)師在雙盲法下完成閱片及判讀。在同一張免疫組化切片中，結(jié)合TTF-1或p40定位于癌細胞，準確評估腫瘤細胞PD-L1的TPS，將PD-L1表達水平分為無表達(TPS<1%)、低表達(1%≤TPS<50%)和高表達(TPS≥50%)。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行兩配對樣本的非參數(shù)檢驗，即Wilcoxon符號秩檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1和TTF-1、p40免疫組化雙重染色定位免疫組化雙重染色顯示：PD-L1呈棕黃色(任何強度、部分或完整的細胞膜線狀或顆粒狀著色)，表達于腫瘤細胞、免疫細胞及正常上皮細胞胞膜；TTF-1呈紅色或紫紅色，定位于肺腺癌細胞(圖1)和正常肺泡上皮細胞胞核；p40呈紅色或紫紅色，定位于鱗狀細胞癌細胞和正常支氣管黏膜基底細胞胞核(圖2)。各指標定位準確，易于判讀。

圖1 腺癌PD-L1/TTF-1免疫組化雙重染色顯示：PD-L1呈細胞膜陽性，TTF-1表達定位于細胞核 圖2 鱗狀細胞癌PD-L1/p40免疫組化雙重染色顯示：PD-L1呈細胞膜陽性及顆粒狀著色，p40表達定位于細胞核 圖3 腺癌，PD-L1陽性細胞包括腫瘤細胞(TTF-1陽性)和免疫細胞(TTF-1陰性)，免疫組化PD-L1/TTF-1雙重染色 圖4 鱗狀細胞癌，PD-L1陽性細胞均為免疫細胞(p40陰性)，癌細胞(p40陽性)PD-L1陰性，免疫組化PD-L1/p40雙重染色 圖5 鱗狀細胞癌：原發(fā)灶部分區(qū)域癌細胞PD-L1陰性，免疫組化PD-L1/p40雙重染色 圖6 鱗狀細胞癌：同一病灶部分區(qū)域癌細胞PD-L1呈強陽性，免疫組化PD-L1/p40雙重染色

2.2 免疫組化雙重染色區(qū)分腫瘤細胞與非腫瘤細胞的PD-L1染色通過TTF-1和p40表達分別定位腺癌細胞和鱗狀細胞癌細胞，可將TTF-1或p40陰性、PD-L1陽性的免疫細胞剔除，不計入TPS(圖3、4)。

2.3 免疫組化雙重染色與PD-L1單染對比分析既往已行PD-L1單染的22例NSCLC經(jīng)免疫組化雙重染色后，19例雙重染色結(jié)果與單染結(jié)果在相同表達區(qū)間，3例與單染結(jié)果不符合(表1)。3例不符合病例中，2例腺癌均為小標本，免疫組化雙重染色切片腫瘤細胞數(shù)量比單染切片的腫瘤細胞數(shù)量明顯減少；1例鱗狀細胞癌為手術(shù)切除標本(原發(fā)灶)，與既往行單染的活檢標本部位(轉(zhuǎn)移灶)不同，本實驗將該病例手術(shù)切除的原發(fā)灶及胸壁轉(zhuǎn)移灶所有腫瘤組織蠟塊均進行了免疫組化雙重染色，結(jié)果顯示原發(fā)灶TPS從<1%到高達65%(圖5、6)，轉(zhuǎn)移灶為5%～25%，呈明確的異質(zhì)性表達。

統(tǒng)計分析，22例NSCLC中14例肺腺癌和8例肺鱗狀細胞癌PD-L1免疫組化單染和雙重染色的TPS結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.112，P=0.357)。因此，PD-L1免疫組化雙重染色方法具有可行性，結(jié)果可靠。

2.4 免疫組化雙重染色結(jié)果的一致性分析三名病理醫(yī)師對所有免疫組化雙重染色病例分別進行盲評，結(jié)果分布區(qū)間一致，TPS數(shù)值范圍為0～10%(均未影響PD-L1表達水平分區(qū)，表1)。而在實際工作中，如腫瘤內(nèi)部混雜有免疫細胞時，可能因難以區(qū)分陽性細胞為腫瘤細胞或免疫細胞，導(dǎo)致不同病理醫(yī)師對單染PD-L1的結(jié)果判讀差異較大，甚至差異可能超過20%(部分位于閾值附近的病例可能影響分區(qū))。借助TTF-1和p40的表達定位于癌細胞，剔除免疫組化單染中不易分辨的PD-L1陽性免疫細胞后，判讀者之間的判讀一致性較單染者高。

表1 免疫組化雙重染色與PD-L1單染TPS對比分析

3 討論

PD-L1可表達于腫瘤細胞和免疫細胞、壞死細胞，在腫瘤細胞與免疫細胞混雜的病例中，免疫組化單染評估TPS存在偏差。PD-L1/TTF-1或PD-L1/p40免疫組化雙重染色技術(shù)所用的兩種抗體種屬、定位和顯色均不同，可避免非特異性著色可能性；并且TTF-1和p40不表達于免疫細胞胞核，可有效區(qū)分腫瘤細胞與免疫細胞，可剔除PD-L1陽性的非腫瘤細胞，從而提高判讀者之間的判讀一致性。邢杰等[5]的實驗結(jié)果亦證實在評估腫瘤細胞PD-L1的表達時，免疫組化雙重染色比單染具有明顯的優(yōu)勢。

本實驗在對既往已行PD-L1檢測的NSCLC病例進行免疫組化雙重染色后，有3例雙重染色結(jié)果與單染結(jié)果差異較大，其中2例是活檢標本，腫瘤細胞數(shù)量不足，另1例的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶之間，以及腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域均存在PD-L1異質(zhì)性表達，其他研究亦發(fā)現(xiàn)這種時間及空間上的異質(zhì)性，以及抗腫瘤治療前后PD-L1表達水平出現(xiàn)不同程度的變化[6-7]。因此，PD-L1在腫瘤細胞中表達水平的時空異質(zhì)性可能是導(dǎo)致部分患者治療獲益有限的原因之一，可能影響PD-L1作為生物標志物的預(yù)測價值。

綜上所述，PD-L1/TTF-1和PD-L1/p40免疫組化雙重染色可剔除非腫瘤細胞的PD-L1非特異性著色，提高判讀者的判讀一致性，有利于準確評估NSCLC中PD-L1的真實表達狀態(tài)，為篩選適用于免疫治療的NSCLC患者及預(yù)后評估提供重要參考。