人乳頭瘤病毒多基因亞型與病毒載量同步檢測在子宮頸病理診斷中的應用

張麗芳，歐陽小娟，余英豪，曲利娟，黃惠娟，王旭洲

女性生殖道黏膜人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是最常見的與病毒相關性傳播疾病，約80%女性50歲前發生過生殖道HPV感染[1]。然而，子宮頸病變及子宮頸癌早期常無明顯癥狀，易忽視，必須行定期篩查才能早診斷、早治療。目前研究表明，子宮頸癌的發生與高危型HPV感染密切相關[2]，且部分細胞學檢查陰性患者亦存在高危型HPV(high-risk HPV, HR-HPV)感染，這些人群亦有發生子宮頸癌的風險。因此，合理有效的篩查方法顯得尤為重要[3]。液基細胞學(liquid-based cytologic test, LCT)聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測方法能夠靈敏檢測HR-HPV感染，但HPV多亞型分型與病毒載量檢測中高敏感性的引物序列錯誤擴增及高拷貝DNA可能導致非特異性表達。因此，探討靈敏高效的子宮頸癌前病變診斷方法尤為重要。本研究旨在探討LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量及DNA濃度控制檢測方法在子宮頸癌早期篩查中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料選取2019年11月～2020年2月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院收治的子宮頸相關疾病患者1 247例，年齡19～60歲(平均40歲)。入選標準：(1)年齡19～60歲，有既往性生活史；(2)無嚴重自身免疫性疾病；(3)非孕期；(4)3天內無陰道沖洗和陰道用藥史以及無性生活史。排除標準：(1)陰道或子宮頸存在感染性疾病或在月經周期；(2)確診子宮頸病變；(3)檢查具有盆腔包塊或其他腫瘤；(4)已有子宮切除。LCT檢測試劑(美國BD醫療公司)；HPV核酸分型檢測試劑(杭州碩世生物公司)。

1.2 方法

1.2.1LCT檢測 采集宮頸外口和頸管部位脫落細胞于載玻片上，用95%乙醇 ∶異丙醇(1 ∶1)固定，經巴氏染色、二甲苯透明、封固。顯微鏡下閱片，按TBS分類法作出病理診斷[4]。

1.2.2陰道鏡病理檢查 對LCT提示炎性抹片中有ASC-US，類似濕疣病變及其低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)以上病變的369例患者，在陰道鏡下對可疑部位進行活檢。以組織病理學檢查結果作為確診標準。

1.2.3HPV多亞型分型與病毒載量檢測 采用熒光定量PCR檢測系統，HPV21分型與病毒載量檢測(包括高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68；中危型：26、53、66、73、82及低危型6、11、81)，按照各亞型擴增CT值測定HPV病毒載量。檢測OD260/OD280比值介于1.8～2.0之間，采用DEPC水對提取DNA的濃度分成6個濃度范圍分別為10、30、50、80、100、200 ng/mL進行倍比稀釋，DNA濃度檢測采用紫外分光光度儀檢測。

2 結果

2.1 LCT細胞學檢測本組1 247例患者中，無上皮內病變或惡性病變(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)[包括有意義不明確的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)和念珠菌/滴蟲感染]878例(70.40%)；炎性抹片有ASC-US，類似濕疣病變175例(14.03%)；LSIL/濕疣病變126例(10.10%)；HSIL/不排除鱗狀細胞癌68例(5.45%)(圖1)，各組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 LCT檢測鏡下分析：A.有ASC-US；B.炎性抹片中有ASC-US，類似濕疣病變；C.LSIL/濕疣病變；D.HSIL/不排除鱗狀細胞癌

2.2 HPV多亞型分型與病毒載量檢測與LCT比較1 247例患者HPV多亞型分型與病毒載量檢測陽性446例(35.76%)，801例結果陰性，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，表1、2)。

表1 LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測高危型HPV病毒分析[n(%)]

2.3 LCT、HPV多亞型分型和病毒載量檢測與陰道鏡組織學診斷三種檢測方法分析LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測共同陽性244例，單獨LCT檢測陽性369例，符合率66.12%(244/369)；LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測方法在炎性抹片有ASC-US及濕疣病變與組織學結果的符合率91.4%(85/93)；LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測LSIL以上病變151例，與組織學結果比較，組織學診斷子宮頸上皮內病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)1級、CIN 2/3級146例陽性，符合率96.7%(146/151)，低于HPV多亞型分型與病毒載量檢測與LCT結果的陽性符合率98.01%(148/151)(表3、4)。

表2 LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測靈敏度、特異度的比較分析

表3 LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測與組織學結果對比

2.4 HPV病毒負荷載量與組織學檢查對比將HPV病毒負荷載量分成4個階段：1E2、1E3、1E4、1E5以上，發現檢測病毒載量越高，子宮頸病變級別越高(表5)。

2.5 DNA濃度與HPV多亞型分型與病毒載量檢測值的相關性檢測擴增CT值在34.5～36.7，對應結果輕微炎癥或無明顯HPV病毒感染75.8%(25/33)，DNA濃度HPV載量檢測值也相應變化，出現假陽性。將33例HPV載量擴增CT值在34.5～36.7之間的病例提取DNA濃度，分成10、30、50、80、100、200 ng/mL不同濃度，DNA濃度經過稀釋控制后結果出現變化，33例HPV多亞型分型與病毒載量檢測值1.56E3～5.78E3的病例DNA濃度控制在10、30、50 ng/mL時，檢測未出現陽性(陰性測定值閾值≥36.7)，濃度為80、100、200 ng/mL時仍為陽性(表6)。

表4 不同子宮頸病變中HPV感染的情況[n(%)]

表5 HPV載量與組織學檢查對比

表6 DNA濃度所對應的HPV多亞型分型與病毒載量檢測值相應變化對比

3 討論

子宮頸癌是目前可以預防和阻斷的婦科惡性腫瘤，大量研究證實HPV感染是子宮頸癌發病的必要因素，有研究報道約82.4%的子宮頸癌前病變都存在HPV感染[4]。近年研究表明，高危型HPV持續感染是子宮頸癌發生的主要危險因素，高危型HPV已作為篩查CIN及子宮頸癌的重要標志應用于臨床。高危型HPV陽性時，需進一步行細胞學或陰道鏡檢查；高危型HPV陰性時，子宮頸癌的發生率低，因此對這部分人群暫不需要進行陰道鏡檢查，避免過度檢查[5]。本研究也顯示，篩查人群中子宮頸上皮細胞異常的HPV多亞型分型與病毒載量同步檢測的陽性率高達96.7%，HSIL為96.6%，LSIL為97%，表明高危型HPV檢出率隨著子宮頸病變嚴重程度顯著增加。目前開展較多的LCT檢查，其病理診斷結果與病理醫師主觀閱片相關，存在假陰性病例的因素[6]。本研究聯合LCT和HPV多亞型分型與病毒載量同步檢測對子宮頸病變進行診斷，其敏感性[91.4%(85/93)]較單獨LCT結果的陽性符合率[43.9%(93/212)]明顯提高。良性病變中部分HPV多亞型分型與病毒載量檢測陽性，行LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量同步檢測篩查，將避免漏診部分ASC-US及LSIL的HPV感染病例。實驗結果表明細胞學及組織學診斷病變程度不斷提升，HPV感染率顯著上升，故對于HPV陽性且細胞學陰性的病例，根據細胞學+HPV聯合檢測結果異常處理流程，高危型HPV陽性病例應行陰道鏡檢查，其他型HPV陽性病例應縮短篩查間隔，重復細胞學和HPV檢測，若持續HPV陽性，不管LCT是否陽性必須行陰道鏡檢查。

本研究以1 247例行LCT檢測病例作為觀察對象，LSIL以上157例，陰道鏡下組織病理學檢查，病理符合率100%；LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測LSIL以上151例，與組織學結果比較符合率96.7%(146/151)，低于HPV多亞型分型檢測與LCT共同陽性結果的符合率98.01%(148/151)，單獨LCT檢測明顯低于LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量同步檢測的檢出率[7-8]。

HPV檢測篩查人群中高危型HPV感染率為446/1 247(35.80%)，在HSIL中HPV陽性率高達96.7%，本組與文獻報道相符[9]，可見HPV陽性預示高級別鱗狀上皮內病變存在或發展為高度病變，HPV檢測高危型HPV病毒載量呈遞增趨勢，顯示病毒載量與HPV多亞型分型檢出例數成正比，隨著高危型HPV的病毒載量不斷增高，子宮頸病變程度提高，2例病理診斷子宮頸癌變的HPV多亞型分型檢測高危型HPV均陽性，提示HPV多亞型分型方法的可靠性。但HPV多亞型分型方法也存在高靈敏性導致的非特異性表達，子宮頸樣本內源性的非特異性RNA/DNA雜交體變性不完全污染以及高DNA濃度產生的非特異性雜交反應會產生假陽性。檢測值在1.56E3～5.78E3時，對應的病理檢測結果輕微炎癥或無明顯HPV病毒感染率為75.8%(25/33)，存在HPV假陽性情況，分析原因：(1)HPV多亞型分型方法過于敏感；(2)取材細胞量過多，提取DNA濃度過高。因此本實驗采用HPV載量檢測值在1.56E3～5.78E3的病例，提取DNA濃度范圍分別為10、30、50、80、100、200 ng/mL，33例HPV多亞型分型病毒載量檢測值在1.56E3～5.78E3的病例DNA濃度控制在10、30、50 ng/mL時，檢測結果為陰性，濃度為80、100、200 ng/mL時結果仍為陽性。因此，LCT聯合HPV多亞型分型與病毒載量檢測，其靈敏性高、特異性強，但可能存在非特異性(假陽性)，必須對標本提取DNA濃度進行質量控制才能準確對初篩高危人群及時發現病變，阻斷子宮頸病變進展，降低子宮頸癌的發病率和病死率。