人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷保護作用研究

劉盈，周滿如，周春

(1.廣州新華學院藥學院，廣東 廣州510520；2.南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515)

人參皂苷Rg1作為人參皂苷中主要的活性成分之一，不僅存在于人參的根中，在其非藥用部位莖、葉、花和果中也有較高的含量，具有抗氧化、抗炎、免疫調節及促進血管生成等多種藥理作用。陳羨人等[1]研究表明，人參皂苷Rg1可通過提高體內抗氧化酶的活性，使血清和心肌丙二醛(MDA)水平明顯降低，從而有效緩解糖尿病大鼠體內的氧化應激反應。容偉等[2]研究表明，人參皂苷Rg1可抑制MAPK/NF-κB信號通路，發揮對缺血后的腦組織的保護作用。此外人參皂苷Rg1可通過抑制Cytc釋放、調控凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達發揮對高脂大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[3]，也可通過PERK-eIF2、ATF4信號通路保護神經元免受谷氨酸誘導的內質網應激[4]。但目前對于人參皂苷Rg1的研究大多數集中在其對心、腎、肝、大腦等組織臟器能量代謝紊亂上[5]，而關于人參皂苷Rg1對HaCaT細胞抗衰老的相關研究卻甚少。本文以100 μg·mL-1H2O2誘導HaCaT細胞建立氧化應激損傷模型，探討人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷的保護作用及其可能機制，為今后人參皂苷Rg1在延緩皮膚衰老的研究進程中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人角質形成細胞(HaCaT cell)細胞株購自美國ATCC公司

1.1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(純度≥98%)(中國藥品生物制品檢定所)；CCK-8試劑盒(美國Biosharp公司)；Hochest33342試劑(美國Sigma公司)；30%H2O2試劑(天津市大茂化學試劑廠)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；10%胎牛血清(德國PAN Biotech公司)；PBS粉末(博士德生物)；活性氧檢測試劑盒(廣州碧云天生物公司)；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器設備 旋轉蒸發儀(上海市貝侖儀器設備有限公司)；超凈工作臺(青島海爾公司)；5%CO2培養箱(美國Thermo公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；酶熒光多功能檢測儀(美國Biotek公司)；細胞培養板(美國Falon公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍干燥機(日本EYELA公司)；離心機(Beckman Coulter公司)；蛋白印跡轉膜槽(美國Bio-rad Criterion)；蛋白垂直電泳槽(賽默飛公司)；蛋白電泳儀(賽默飛公司)；FluorChem HD2 型化學發光凝膠成像儀(賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞培養 取適量已活化的HaCaT細胞原液于含10%精制小牛血清和青霉素、鏈霉素各100 μg·mL-1的DMEM培養基中，于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中培育。取生長對數期的HaCaT細胞，以1×105個/mL密度的細胞懸液接種于96孔細胞板中，每孔200 μL，常規培養(37 ℃，5% CO2)24 h，備用。

1.2.2 細胞損傷實驗 將HaCaT細胞分為空白組和損傷組，每組設5個平行孔。損傷組以1×105個/mL密度的細胞懸液接種于96孔細胞板中，每孔200 μL，空白組加入相同體積培養基，培養24 h。采用CCK-8法篩選H2O2濃度的分組為25、50、100、150、200 mmol·L-1每組5個復孔。取出事先培養好的HaCaT細胞，將原培養基吸出后分別加入對應體積的0.03% H2O2溶液和DMEM培養基使每孔體積為200 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養作用2 h。換培養基繼續培養24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值。細胞存活率通過以下公式計算：存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%。

1.2.3 CCK-8染色法測定細胞存活率 將HaCaT細胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護組。空白組給予完全培養基，對照組加入H2O2溶液使體系終濃度為最佳損傷濃度；人參皂苷Rg1保護組分為3個濃度計量組：5、10、15 mg·L-1。先按濃度加入人參皂苷Rg1預處理2 h，再加入最佳濃度的H2O2溶液作用2 h進行氧化損傷。換培養基終止反應后再在37 ℃、5% CO2培養箱中培育24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值。計算每孔中細胞存活率。

1.2.4 Hochest染色觀察細胞凋亡 將HaCaT細胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護組(15 mg·L-1)。24孔板中的細胞經預處理及培養后，使用PBS緩沖液反復清洗3次，加入Hochest33342熒光試劑，染色30 min。使用光學顯微鏡觀察HaCaT細胞形態變化及凋亡情況。

1.2.5 活性氧檢測試劑盒(ROS Assay Kit)測定細胞ROS水平 將HaCaT細胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護組，每組設5個平行孔，將HaCaT細胞接種到6孔細胞培養板中，每孔5 mL，接種密度為每孔1×105個細胞，培養24 h。人參皂苷Rg1保護組加入5、10、15 mg·L-1的人參皂苷，每孔250 μL，空白組和損傷組補充相同體積的DMEM空白培養基，孵育3 h。損傷組與人參皂苷Rg1保護組加入損傷濃度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育結束后移除培養基，PBS緩沖液清洗2次，按照ROS檢測試劑盒的說明書步驟進行后續操作，最后置于激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光強度，激發波長488 nm，發射波長525 nm。以各組細胞熒光強度代表ROS水平。

1.2.6 Western blot檢測增殖凋亡相關標志蛋白 將HaCaT細胞分為空白組、損傷組與人參皂苷Rg1保護組。每組設5個平行孔，將HaCaT細胞接種到6孔細胞培養板中，每孔5 mL，接種密度為每孔1×105個細胞，培養24 h。人參皂苷Rg1保護組加入5、10、15 mg·L-1的人參皂苷，每孔250 μL，空白組和損傷組補充相同體積的DMEM空白培養基，孵育3 h。損傷組與人參皂苷Rg1保護組加入損傷濃度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育結束后移除培養基，PBS緩沖液清洗2次，結束后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測caspase-3、caspase-6、caspase-8、GAPDH增殖凋亡相關標志蛋白的表達及磷酸化水平。

2 結果

2.1 H2O2損傷后 HaCaT細胞存活率 與空白組比較，25、50、100、150、200 mmol·L-1的H2O2損傷處理HaCaT細胞后，各組HaCaT細胞存活率均有下降(P<0.05)。在H2O2濃度為100 mmol·L-1時，細胞損傷率達50%左右，作為后續實驗損傷組中H2O2的加入量(見圖1)。

圖1 不同濃度H2O2損傷后HaCaT細胞存活率

2.2 人參皂苷Rg1預處理后各組HaCaT細胞存活率 與空白組比較，H2O2損傷組HaCaT細胞存活率明顯降低，與H2O2損傷組比較，5、10、15mg·L-1的人參皂苷Rg1保護組HaCaT細胞存活率明顯升高，10、15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護組中HaCaT細胞存活率升高最為明顯，具有統計學差異(P<0.05)，表明人參皂苷Rg1對H2O2氧化損傷后的HaCaT細胞增殖有一定的作用(見圖2)。

圖2 人參皂苷Rg1預處理后各組HaCaT細胞存活率

2.3 人參皂苷Rg1預處理后各組HaCaT細胞凋亡情況 與空白組比較，H2O2損傷組細胞呈亮藍色，出現細胞核皺縮，染色質聚集的現象，凋亡細胞數量明顯增多，與H2O2損傷組比較，5、15 和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護組細胞凋亡數量明顯減少，表明人參皂苷Rg1對氧化損傷后的HaCaT細胞凋亡有一定的抑制作用(見圖3)。

圖3 人參皂苷Rg1預處理后各組HaCaT細胞凋亡情況

2.4 人參皂苷Rg1處理后各組HaCaT細胞ROS水平 與空白組比較，H2O2損傷組細胞中ROS水平升高，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護組細胞中ROS水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細胞中ROS水平(見圖4)。

圖4 人參皂苷Rg1處理后各組HaCaT細胞ROS水平

2.5 Western blot檢測增殖凋亡相關標志蛋白 與空白組比較，H2O2損傷組細胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所升高，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護組細胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細胞凋亡相關標志蛋白的表達(見圖5)。

圖5 Western blot檢測增殖凋亡相關標志蛋白

3 討論

ROS被認為是造成機體氧化應激的主要原因，包括氧自由基和非自由基的含氧產物，如羥自由基(-OH)、超氧陰離子(O2-)、脂質過氧化物(ROO-、RO-與ROOH)及過氧化氫(H2O2)等[6]。大量的ROS超出了機體清除能力，破壞了機體正常的氧化/還原平衡狀態，造成蛋白質、脂質、核酸等生物大分子物質氧化損傷和功能紊亂，從而影響機體正常代謝。本研究發現,與H2O2損傷組比較，5、15 和15 mg·L-1的人參皂苷Rg1保護組中HaCaT細胞中ROS含量呈濃度依賴性降低，表明人參皂苷Rg1可通過抑制ROS產生和累積從而抑制細胞氧化應激損傷，提高細胞活力，維持正常細胞形態。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族，是執行細胞凋亡的關鍵信號途徑[7]。在正常的細胞內，caspase家族以非酶活性前體存在，經由細胞內外多種促凋亡的信號激活，進而介導凋亡。其可分為兩大類，一類是起始觸發蛋白caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10，另一類是效應執行蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7。起始觸發caspase在外來蛋白信號的作用下被切割激活，激活的起始caspase對效應執行caspase進行切割并使之激活，被激活的效應執行caspase通過對caspase靶蛋白的水解，導致程序性細胞死亡[8]。caspase-3 是凋亡最直接的執行者，caspase-8位于caspase-3的上游，構成級聯激活[9]。在本研究中，與H2O2損傷組比較，5、15和15 mg·L-1人參皂苷Rg1保護組中，HaCaT細胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8蛋白水平均有所降低，表明人參皂苷Rg1在一定程度上可降低細胞凋亡相關標志蛋白的表達。此外，caspase-8和caspase-3的水平變化一致，提示二者可能存在級聯反應，caspase-8對caspase-3有一定程度的激活作用。

本研究采用100 μg·mL-1的H2O2誘導細胞，建立氧化應激損傷模型，發現人參皂苷Rg1可顯著提高H2O2誘導氧化損傷的HaCaT細胞存活率，緩解細胞核的損傷狀態，減少凋亡細胞數量，同時有效降低HaCaT細胞內ROS 水平，Western blot 檢測結果顯示人參皂苷Rg1一定程度上可降低細胞凋亡相關標志蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-8 水平，綜上所述，人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷具有一定的保護作用，其機制可能與增強細胞清除自由基能力及抑制凋亡相關。