ICP-MS法研究含朱砂中成藥中的汞元素在人工胃液中的溶出特性

王辰洋，金鵬飛，胡欣

(1.山東大學齊魯醫院藥劑科，山東 濟南 250012；2.北京醫院藥學部，國家老年醫學中心，中國醫學科學院老年醫學研究院，北京市藥物臨床風險與個體化應用評價重點實驗室<北京醫院>，北京 100730)

朱砂(主要成分是硫化汞)首載于《神農本草經》，又名丹砂辰砂，性甘、微寒；有毒，歸心經；臨床上用于心悸易驚，失眠多夢，癲癇發狂，小兒驚風，視物昏花，口瘡，喉痹，瘡瘍腫毒[1]。近年來盲目使用含朱砂中成藥的現象非常普遍，因服用朱砂導致不良反應或中毒事件時有發生[2-8]。由于硫化汞難以溶解，在人體內也不能被吸收，朱砂的毒性主要來源于其中含有的游離汞及可溶性汞[9]，因此不但要考慮中成藥中汞總含量高低，更要研究其口服后在胃腸液中的溶出特性。

兒童各系統、器官功能尚未發育完善，更易受到損傷。就兒童而言，影響較大的是神經系統發育[10]。《中國藥典》收錄許多含朱砂的兒科中成藥，以一捻金和小兒金丹片應用較多。一捻金由大黃、朱砂等五味中藥制成，具有消食導滯、祛痰通便之功效，臨床上主要用于脾胃不和、痰食阻滯所致的積滯[1]。小兒金丹片由朱砂、橘紅、川貝母等26味中藥制成，具有祛風化痰、清熱解毒之功效，臨床上主要用于外感風熱、痰火內盛所致的感冒[1]。本文作者選取一捻金、小兒金丹片為代表，應用電感耦合等離子質譜(ICP-MS)技術，測定不同廠家藥品中的汞元素在水、人工胃液中的溶出特性，初步探討可能被人體吸收的汞含量，為該藥的安全性評價提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 7500a電感耦合等離子質譜(ICP-MS，配備Babington霧化器，鎳采樣錐和截取錐，美國Agilent公司)；MARS X-press密閉微波快速消解系統(美國CEM公司)；超純水處理系統(法國Millipore公司)；梅特勒 XP 205電子天平(瑞士Mettler公司)；SHZ-A恒溫振蕩器(上海喬躍電子有限公司)；S10H 型超聲儀[致微(廈門)儀器有限公司]。

Hg單元素標準溶液(C=1 000 mg·L-1，國家標準物質研究中心)；NIST西紅柿葉標準物質(SRM1573a，美國國家標準與技術研究院)；調諧液：Li、Y、Ce、Tl、Co混合液(編號：5184-3566，C=10 μg·L-1，美國Agilent公司)；混合內標溶液(6Li、45Sc、72Ge、89Y、115In、159Tb、209Bi，C=10 mg·L-1，編號：5183-4680，美國Agilent公司)；濃硝酸(BV-Ⅲ級，北京化學試劑研究所)；鹽酸(優級純，北京興青紅精細化學品科技有限公司)；胃蛋白酶(Sigma公司)；超純水由Millipore超純水系統制得,其他化學試劑均為優級純。

一捻金藥品(市售)：①粉劑，廠家代碼：YB，批號：2101031；②粉劑，廠家代碼：YT，批號：130901；③膠囊，廠家代碼：YF，批號：20130301。小兒金丹片藥品(市售)：①薄膜衣片，廠家代碼：DX，批號：AL29174；②薄膜衣片，廠家代碼：DL，批號：130202。

2 方法

2.1 ICP-MS工作參數 RF功率：1 350 W，采樣深度：7.8 mm，載氣流速：0.96 L· min-1，蠕動泵轉速：6 r·min-1，霧化室溫度：2 ℃，干擾方程：EPA200-8，采樣模式：spectrum，全定量，采樣元素：待測元素(202Hg)和內標元素(209Bi)，元素的積分時間：0.1 s，重復次數：3次，采樣前蠕動泵提升速度：12 r·min-1，提升時間：30 s，采樣前蠕動泵平衡速度6 r·min-1，平衡時間：70 s。

2.2 內標溶液的制備 精密吸取混合內標溶液2.0 mL，以2%硝酸溶液(V/V)稀釋成濃度為2.0 μg·L-1的混合溶液10 mL，搖勻，即得。

2.3 人工胃液的制備 取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL，加胃蛋白酶10 g，加水稀釋成1 000 mL，搖勻，即得。

2.4 汞標準品系列溶液的制備 精密量取Hg單元素標準溶液1.0 mL，用2%硝酸溶液(V/V)稀釋至100 mL，得到儲備液Ⅰ(Hg 10 μg·mL-1)，再分別精密量取Hg儲備液Ⅰ 0.50 mL，用2%硝酸溶液(V/V)稀釋至100 mL，得到儲備液Ⅱ(Hg 50 μg·L-1)，再分別精密量取儲備液Ⅱ適量，用2%硝酸溶液(V/V)稀釋制成濃度分別為0、0.2、0.5、1、2、5 μg·L-1的系列標準溶液。

2.5 汞總量測定供試品溶液的制備

2.5.1 取一捻金10袋，混勻，稱取粉末0.05 g(約含Hg 2.44 mg)，精密稱定，置耐高溫高壓的微波消解罐中，加入濃硝酸4 mL和濃鹽酸1 mL，混勻，將消解罐置于50 ℃水浴中預消解10 min，取出，擦干，放冷，加蓋內墊和外蓋，置于微波快速消解儀中，以下列程序梯度升溫消解：0～5 min升溫至120 ℃，5～10 min恒溫120 ℃；10～15 min升溫至150 ℃，15～25 min恒溫150 ℃；25～30 min升溫至180 ℃，30～50 min恒溫180 ℃。待消解完全后，放冷，消解液轉移至100 mL聚乙烯樣品瓶中，用超純水定容后，搖勻，即得供試品溶液。供試品溶液用2%硝酸溶液(V/V)稀釋2.5×104倍后進樣測定。在制備供試品溶液的同時，不加樣品只加硝酸同法制備試劑空白溶液，作為空白校正。

2.5.2 取小兒金丹片20片，粉碎、研成細粉，稱取粉末0.05 g(約含Hg 7.62 mg)，精密稱定，置耐高溫高壓的微波消解罐中，加入濃硝酸4 mL和濃鹽酸1 mL，混勻，將消解罐置于50 ℃水浴中預消解10 min，取出，擦干，放冷，加蓋內墊和外蓋，置于微波快速消解儀中，以下列程序梯度升溫消解：0～5 min升溫至120 ℃，5～10 min恒溫120 ℃；10～15 min升溫至150 ℃，15～25 min恒溫150 ℃；25～30 min升溫至180 ℃，30～50 min恒溫180 ℃。待消解完全后，放冷，消解液轉移至100 mL聚乙烯樣品瓶中，用超純水定容后，搖勻，即得供試品溶液。供試品溶液用2%硝酸溶液(V/V)稀釋2.5×104倍后進樣測定。在制備供試品溶液的同時，不加樣品只加硝酸同法制備試劑空白溶液，作為空白校正。

2.5.3 取NIST西紅柿葉標準物質約0.05 g，精密稱定，置耐高溫高壓的微波消解罐中，加入濃硝酸4 mL和濃鹽酸1 mL，混勻，將消解罐置于50 ℃水浴中預消解10 min，取出，擦干，放冷，加蓋內墊和外蓋，置于微波快速消解儀中，以下列程序梯度升溫消解：0～5 min升溫至120 ℃，5～10 min恒溫120 ℃；10～15 min升溫至150 ℃，15～25 min恒溫150 ℃；25～30 min升溫至180 ℃，30～50 min恒溫180 ℃。消解完成后電熱板揮去硝酸，用2%硝酸溶液(V/V)定容到50 mL，不經稀釋直接測定。

2.6 溶出汞供試品溶液的制備

2.6.1 一捻金人工胃液溶出液 取一捻金一次服用量(約含Hg 29.28 mg)，精密稱定，置于錐形瓶中，加入人工胃液100 mL，37 ℃超聲提取1 h，過濾，用少量人工胃液清洗濾渣3次，合并濾液并用人工胃液定容至200 mL，搖勻，13 000 r·min-1離心20 min，取上清液應用0.45 μm 濾膜過濾，取1 mL上清液，1%的鹽酸溶液(V/V)定容到50 mL，搖勻，即得。

2.6.2 小兒金丹片人工胃液溶出液 取小兒金丹片粉末一次服用量(約含Hg 91.38 mg)，精密稱定，置于錐形瓶中，加入人工胃液100 mL，37 ℃超聲提取1 h，13 000 r·min-1離心20 min，取上清液應用0.45 μm 濾膜過濾，取2 mL上清液，1%的鹽酸溶液(V/V)定容到50 mL，搖勻，即得。

2.6.3 一捻金水溶出液 取一捻金一次服用量(約含Hg 29.28 mg)，精密稱定，置于錐形瓶中，加水100 mL，37 ℃超聲提取1 h，過濾，用少量水清洗濾渣3次，合并濾液并用水定容至200 mL，搖勻，13 000 r·min-1離心20 min，取上清液應用0.45 μm 濾膜過濾，取1 mL上清液，1%的鹽酸溶液(V/V)定容到50 mL，搖勻，即得。

2.6.4 小兒金丹片水溶出液 取小兒金丹片粉末一次服用量(約含Hg 91.38 mg)，精密稱定，置于錐形瓶中，加水100 mL，37 ℃超聲提取1 h，13 000 r·min-1離心20 min，取上清液應用0.45 μm 濾膜過濾，取2 mL上清液，1%的鹽酸溶液(V/V)定容到50 mL，搖勻，即得。

2.7 測定 將空白溶液、標準品系列溶液、供試品溶液分別注入電感耦合等離子體質譜儀中，測定Hg元素和內標元素的信號響應值，根據標準曲線測得供試品溶液中Hg元素的濃度。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 線性范圍和定量限 以汞元素和內標鉍元素的響應比為縱坐標，以質量濃度為橫坐標，由ChemStation軟件自動繪制汞元素的標準曲線并計算線性相關系數和定量限(LOD)，汞元素在0～5 μg·L-1濃度范圍內，線性方程為Y=0.0187 3X+0.019 16(r=0.999 5)，定量限為0.065 μg·L-1。結果表明：該方法的線性和靈敏度良好。

3.1.2 總汞測定的重復性和精密度 分別取一捻金粉末(廠家代碼：YB)0.05 g和小兒金丹片粉末(廠家代碼：DX)0.025 g，精密稱定，按“2.5”項下的規定操作，平行測定6份樣品，一捻金和小兒金丹片汞總量測定結果的RSD分別為7.4%和6.2%(n=6)，表明方法重復性良好。取其中一份一捻金和小兒金丹片供試品溶液，連續進樣6次，汞元素響應與內標鉍元素的響應比值的RSD分別為2.7%和2.6%(n=6)，表明系統精密度良好。

3.1.3 溶出汞測定的重復性和精密度 精密稱取一捻金和小兒金丹片粉末各約一次服用量，按“2.6”項下的規定操作，平行試驗6份，測定，結果顯示，一捻金中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分別為39.2%和75.2%(n=6)，小兒金丹片中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分別為39.8%和48.6%(n=6)，溶出率很低，RSD很大。取其中一份一捻金和小兒金丹片溶出液，連續進樣6次，結果顯示：一捻金中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分別為8.8%和7.6%(n=6)，小兒金丹片中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分別3.1%和4.9%(n=6)，表明該方法精密度良好。

3.1.4 穩定性試驗 分別取“3.1.2”項下汞總量供試品溶液與“3.1.3”項下水溶出液、人工胃液溶出液，于4 ℃冰箱內保存，分別在0、1、2、4、8、12、24 h測定，汞元素響應與內標鉍元素的響應比值的RSD用于考察方法穩定性。一捻金和小兒金丹片汞總量供試品溶液在12 h內RSD分別為5.5%和9.6%。結果表明，12 h內穩定性良好。一捻金中汞元素在水、人工胃液溶出液2 h的RSD分別為10.6%和2.8%；小兒金丹片中汞元素在水、人工胃液溶出液的2 h 的RSD分別為2.2%和5.6%。結果表明，各溶液只在2 h內穩定，需要及時測定。

3.1.5 加樣回收試驗 分別稱取一捻金約0.05 g和小兒金丹片粉末約0.025 g，各6份，精密稱定，分別加入Hg單元素標準溶液(1 000 μg·mL-1)2 mL，按“2.5”項下的規定操作，測定，得到汞含量，以加標前后汞含量的差值除以加入的汞含量計算汞總量測定的回收率。取“2.6”項下的一捻金的水、人工胃液溶出液各1 mL或小兒金丹片的水、人工胃液溶出液各2 mL，各6份，分別加入“2.4”項下的汞儲備液Ⅱ(50 μg·L-1)1 mL，用1%的鹽酸溶液(V/V)定容到50 mL，測定，以加標前后汞含量的差值除以加入的汞含量計算溶出液汞測定的回收率。回收率結果見表1。汞總量回收率分別為89.48%和117.4%，汞在水、人工胃液中的回收率在103.2%～110.9%之間，滿足分析的要求。

表1 汞總量測定及水、人工胃液中汞元素測定的回收率結果

3.2 標準物質測定結果 取標準物質約0.05 g，精密稱定，按“2.5”項下的規定操作，平行試驗6份，測定，計算Hg元素的含量。標準物質Hg含量的標準值為0.034±0.004，測定值為0.032±0.001(mean±SD,n=7)，測定值和標準值基本一致，表明方法具有較好準確性。

3.3 樣品測定及結果分析 應用建立的方法對3個不同廠家的一捻金和2個不同廠家的小兒金丹片的汞總量以及在水與人工胃液中的溶出率進行了研究。每個樣品平行試驗6份，計算平均值，測定結果見表2。從測定結果分析，可得出以下結論：①按照《中國藥典》2010年版規定的標準處方生產的一捻金中Hg的理論含量(以朱砂含HgS不少于96%計)應分別不少于46.85 mg·g-1，小兒金丹片小片Hg的含量在137.98 mg·g-1至168.17 mg·g-1之間，小兒金丹片大片Hg的含量在137.98 mg·g-1至166.73 mg·g-1之間，而測得各廠家一捻金中Hg含量分別為39.58、51.78、54.76 mg·g-1，各廠家小兒金丹片Hg含量分別為139.4、142.6 mg·g-1，表明某廠家一捻金膠囊存在朱砂投料不足的現象；②各廠家一捻金的Hg在人工胃液中的溶出率分別為0.002%、0.012%、0.020%，在水中的溶出率分別為0.025%、0.017%、0.018%，表明各廠家一捻金中的Hg在水和胃液中溶出率很低，并且溶出特性不同；各廠家小兒金丹片中的Hg在人工胃液中的溶出率均為0.004%，在水中的溶出率分別為0.011%和0.009%，提示各廠家小兒金丹片Hg在人工胃液中的溶出率和在水中的溶出率均很低，人工胃液中溶出率更低。各廠家一捻金和小兒金丹片在胃液中每天的溶出汞的量[胃腸溶出汞(μg·g-1)×每日劑量(g)]在1.11～11.59 μg之間。由于溶出率較低，對于這類藥物的汞毒性值得進一步研究，其汞元素的限量標準也值得進一步探討。

表2 一捻金和小兒金丹片汞元素總量、水中溶出率和胃液中溶出率

4 討論

4.1 《中國藥典》2010年版與2020年版關于一捻金和小兒金丹片的區別 由于作者做此試驗之時，執行的是《中國藥典》2010年版，而《中國藥典》2010年版里只有一捻金[1]的質量標準，并且沒有對HgS含量進行規定，因此用處方中朱砂百分含量(以朱砂含HgS不少于96%計)計算Hg的理論含量為依據。《中國藥典》2020年版不僅增加了一捻金膠囊[1]的質量標準，還對一捻金和一捻金膠囊進行HgS含量測定，一捻金膠囊中規定的HgS含量折算成Hg含量(mg·g-1)應在40.24 mg·g-1至54.62 mg·g-1之間，一捻金粉劑中Hg含量應在39.53 mg·g-1至53.90 mg·g-1之間，按此標準，“3.3”項下結果測定依舊提示一捻金膠囊中朱砂投料不足的問題。對于小兒金丹片中HgS含量測定的范圍，《中國藥典》2010年版和2020年版[1]沒有區別。

4.2 不同消解體系的選擇 不同的消解體系對樣品的破壞程度不同。本文研究了HNO3、HNO3-HF、HNO3-HCl-H2O2及不同比例HNO3-HCl體系，結果發現，HNO3和HNO3-HF體系消解后樣品均有沉淀，不能完全消解；HNO3-HCl-H2O2體系用量比例分別為4.5∶1.5∶1、4∶2∶1、3∶3∶1、1.5∶4.5∶1及HNO3-HCl比例為4∶1消解后樣品沒有沉淀并且煙極少，均可消解完全；本著簡單方便的試驗原則，選用HNO3-HCl比例為4∶1作為樣品消解條件。

4.3 消除記憶效應 試驗中發現，在長時間測定汞元素過程中，會出現向上的基線漂移。汞對ICP-MS具有很強的記憶效應。故在測定汞標準曲線及進樣過程中插入10%鹽酸溶液 (V/V)淋洗進樣系統，可較好消除汞元素的記憶效應，改善汞的回收率。

4.4 不同過濾方式及不同孔徑濾膜的選擇 本文研究了濾紙抽濾法、0.2、0.45和0.8 μm孔徑濾膜過濾一捻金和小兒金丹片的水和人工胃液溶出液。用濾紙抽濾時，由于朱砂是極細粉入藥，粉末顆粒過細，先過濾的濾液中有顆粒穿過濾紙進入濾液，而后沉淀堵住濾孔，致使每次過濾的結果都不一樣。用0.2 μm孔徑濾膜時，由于孔徑過小，以及對顆粒的吸附導致濾液中汞含量大幅下降，0.8 μm孔徑濾膜過濾溶出液后，由于粉末顆粒過細，濾液中仍有肉眼可見顆粒物存在，不僅顆粒堵塞儀器，也導致測定結果不準確。

從一捻金和小兒金丹片的分析結果來看，雖然含Hg量高，但只有不到0.02%可在胃液中溶出，下一步將繼續對胃液中溶出汞的形態進行分析，從而為這類制劑汞毒性的評價提供參考，為我國礦物藥的出口走向世界提供依據。