霍山石斛DhGMDS基因克隆及低溫脅迫下表達

吳麗萍，蘇興隆，王兆健，俞年軍，彭代銀,2，邢世海,2*

(1 安徽中醫藥大學 藥學院，合肥 230012；2 安徽省中醫藥科學院中藥資源保護與開發研究所，合肥 230012)

霍山石斛 (Dendrobiumhuoshanense)又名米斛，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬多年生附生草本植物，莖為其主要的藥用部位，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]。現代研究表明，霍山石斛含有多糖、生物堿、酚酸、氨基酸等多種藥用成分[2-4]。其中多糖是其主要的活性成分，主要由葡萄糖、甘露糖等單糖構成，具有抗白內障、抗氧化、免疫調節、保肝等藥理活性[5-7]。GDP-甘露糖 4,6-脫水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase,GMDS)是GDP-L-巖藻糖合成途徑中的關鍵酶，可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，在GDP-酮-6-脫氧甘露糖3,5-表異構酶的催化作用下，轉化成GDP-L-巖藻糖, 從而參與多糖的形成[8]。GDP-L-巖藻糖是一種廣泛存在于生物中的糖基供體和代謝中間產物，參與生命代謝的調節，合成工藝十分復雜[9]。有關GDP-甘露糖4，6-脫水酶基因在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、發菜(Nostocflagelliforme)及高山被孢霉(Mortierellaalpina)等[8-14]物種中已被報道，目前對DhGMDS基因的相關研究還未見報道。

石斛屬多數植物對生態環境要求嚴格, 喜溫怕冷，生長適溫為18～32 ℃，一般最佳生長溫度為25 ℃， 在5 ℃以下或35 ℃以上會停止生長[15-16]。北方地區常年氣溫極低，低溫造成的冷害、凍害，嚴重影響其生存、產量和品質。霍山石斛主產于大別山區安徽霍山及鄰近地區，低溫不利于霍山石斛在北方的引種栽培和推廣。因此，研究霍山石斛的耐寒性，克隆霍山石斛抗性相關基因，解析其脅迫響應和抗性機制，具有重要的科學意義和應用價值[17]。

本研究基于前期霍山石斛轉錄組數據，對霍山石斛GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因(DhGMDS)及其啟動子進行克隆及分析，采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析DhGMDS基因在霍山石斛不同部位的相對表達情況，并分析低溫(4 ℃)脅迫處理下DhGMDS基因的表達，為進一步解析霍山石斛抗寒機制和遺傳改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與脅迫處理

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)成熟未開裂的蒴果采自安徽省霍山縣太平畈鄉王家店村，由“霍山石斛非物質文化遺產傳人”何祥林先生提供。1)前期處理。將蒴果用洗衣粉水(5 g洗衣粉加入300 mL水) 浸泡15 min，流水沖洗 30 min；置于無菌條件下，用體積分數75%乙醇浸泡震蕩45 s，無菌水潤洗2次；再用體積分數30% NaClO溶液浸泡15 min，無菌水潤洗5次；吸干蒴果表面水分，橫向切開，接種于萌發培養基(1/2 MS，含0.2 mg·L-1NAA、30.0 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)，于溫度(23±2) ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx條件下，培養霍山石斛實生苗。2)低溫(4 ℃)脅迫處理。取長勢相近的一年生霍山石斛實生苗，于溫度4 ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx條件下培養，處理0、24、48和72 h后分別取整株霍山石斛，清水洗凈，濾紙吸干水分，用于總RNA和gDNA的提取。每個處理組設置3個生物重復，每個重復3盆霍山石斛。

1.2 方 法

1.2.1 霍山石斛總RNA及基因組DNA的提取采取Liu等[18]方法提取霍山石斛總RNA，使用FastQuant RT Kit (Tiangen Biotech，北京) 進行反轉錄合成cDNA；采用改良的CTAB方法[19]提取霍山石斛基因組DNA。

1.2.2DhGMDS基因克隆根據課題組前期的霍山石斛轉錄組數據[20]及序列相似性比對結果，篩選了一個參與多糖合成途徑的編碼GDP-甘露糖 4,6-脫水酶的候選基因，命名為DhGMDS，用 Primer 5.0 軟件設計特異引物進行PCR擴增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)。以霍山石斛總RNA反轉得到的cDNA為模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R為引物進行PCR擴增。反應體系：PrimeSTAR?DNA Polymerase 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，無菌水22 μL。反應參數為：95 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，30個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒(Tiangen Biotech，北京)純化回收 PCR產物，純化后與 pMD18-T 載體過夜連接，然后轉化DH5α 感受態，進行挑斑篩選，將含有目的片段的陽性菌送生工生物工程上海股份有限公司測序。使用引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′，以霍山石斛基因組DNA為模板進行PCR擴增，克隆該基因在基因組上的全長序列，送生工生物工程上海股份有限公司測序。

1.2.3DhGMDS基因的生物信息學分析根據得到的cDNA序列，在線進行該基因及其他同源序列的相似性比對(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)和蛋白質理化性質預測分析(http://web.expasy.org/protparam)[21]；用TMHMM在線程序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)[22]分析該蛋白質的可能跨膜區；利用PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)[23]預測該基因編碼蛋白的亞細胞定位；利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測該蛋白的二維結構；用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)[24]進行編碼蛋白的三維結構預測；并利用MEGA X軟件[25](neighbor-joining，鄰位相連法) 構建該基因的系統進化樹。

1.2.4DhGMDS基因啟動子的克隆和元件功能分析利用Primer 5.0設計Genome Walking特異引物SP1、SP2和SP3(表1)，使用染色體步移試劑盒(Genome Walking Kit, TaKaRa公司)克隆DhGMDS啟動子。PCR反應體系：染色體步移三輪PCR模板依次為霍山石斛基因組DNA、第一輪PCR產物(稀釋100倍)、第二輪PCR產物(稀釋100倍)1.0 μL、dNTPs (2.5 mmol·L-1) 8.0 μL、10 × LA PCR 緩沖液5 μL、TaKaRa LA Taq 0.5 μL、AP2 (100 μmol·L-1) 1.0 μL和SP(10 μmol·L-1) 1.0 μL；ddH2O將反應體系補充到50 μL。將每輪擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取第三輪得到的特異片段，膠回收試劑盒回收純化片段；再將目的片段連接到pMD18-T載體上，轉化、測序。采用數據庫(http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)[26]分析預測順式作用元件。

表1 霍山石斛 DhGMDS 基因分析所需引物

1.2.5DhGMDS基因的qRT-PCR表達分析分別提取霍山石斛根、莖、葉、花各組織的RNA，以反轉錄cDNA為模板，使用Roche Z480實時熒光定量PCR儀，分析DhGMDS基因在霍山石斛根、莖、葉、花各組織表達情況；分別提取不同時間(0、24、48和72 h)低溫處理后整株霍山石斛RNA，以反轉錄cDNA為模板，分析DhGMDS基因低溫處理的表達規律。每個樣品做3個平行實驗，3個生物學重復。以DhGMDS-RT-F和DhGMDS-RT-R為引物，以18SrRNA作為內參基因，參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑 (TaKaRa) 說明書進行熒光定量PCR擴增，采用2-ΔΔCt法對數據進行定量分析，使用GraphPad Prism 8軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANONVA)，用Duncan’s 多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 DhGMDS基因的克隆

為了獲得DhGMDS基因的cDNA序列，以霍山石斛總RNA反轉得到的cDNA為模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R為引物進行PCR擴增，得到的產物如圖1的第1條帶，約1 100 bp，測序結果顯示，該基因的開放閱讀框(ORF) cDNA序列為1 134 bp，編碼377個氨基酸，DhGMDS基因GenBank登錄號MW855573。 為了獲得DhGMDS基因的gDNA序列，以霍山石斛的基因組DNA為模板，采用特異性引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′進行PCR擴增，得到的產物如圖1的第2條帶，約1 500 bp,經測序表明該基因的gDNA序列為1 523 bp，其GenBank登錄號MZ439829。與該基因的cDNA序列比較，發現DhGMDS基因無內含子，只有1個外顯子。

2.2 DhGMDS蛋白的特征分析

霍山石斛DhGMDS蛋白相對分子質量為42.04 kD，包含377個氨基酸，蛋白分子式為C1867H2887N527O561S11，原子總數為5 853，等電點6.54，該蛋白不穩定系數為43.88，預估的半衰期在體外哺乳動物的網織紅細胞是30 h、酵母體內大于20 h、大腸桿菌體內大于10 h，脂肪族指數76.10，總平均親水性為-0.423。跨膜區分析顯示該蛋白的1～377個氨基酸未形成跨膜區結構域，屬非跨膜蛋白。

霍山石斛DhGMDS蛋白亞細胞定位預測結果表明：該蛋白定位于細胞質的可能性最大，為52.2%；定位于細胞核和線粒體可能性分別為34.8%和13.0%。

蛋白質二級結構域預測顯示，約有36.87% 的氨基酸(139個)以α螺旋形式存在，13.53% 的氨基酸(51個)為延伸主鏈，49.60% 的氨基酸(187個)為無規則卷曲，表明該蛋白二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主。用SWISS-MODEL對DhGMDS蛋白的氨基酸序列進行三維結構預測，經該軟件數據庫比對，將與數據庫中相似度最高的1n7h.1.A建模[24]，GMQE(global model quality estimation，全局模型質量評估)值為0.83，該預測模型可靠，結果如圖2所示其結構主要以α螺旋和無規則卷曲為主，與二級結構預測相符。

2.3 一致性分析及進化樹的構建

采用DNAMAN軟件對霍山石斛等 7 種植物的GDP-甘露糖 4,6-脫水酶氨基酸序列進行多重比對分析。結果(圖3)顯示，霍山石斛的 DhGMDS與黃花石斛 (Dendrobiumcatenatum, LOC110093839)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris, LOC110020353)、油棕(Elaeisguineensis, LOC105054659)等物種的GMDS氨基酸序列一致性較高，在79.00%～99.03%之間。

將DhGMDS基因的核苷酸序列在NCBI上進行同源搜索，選取霍山石斛DhGMDS與馬來西亞蕉(M.acuminatasubsp.malaccensis)、水稻(Oryzasativa)、盾葉薯蕷(D.cayenensissubsp.rotundata)等12種植物的GMDS核苷酸序列進行多重比對。結果 (圖4) 表明，霍山石斛的DhGMDS基因與黃花石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭的GMDS基因聚為一類，其親緣關系近。

2.4 DhGMDS基因啟動子的克隆及元件分析

依據克隆的DhGMDS基因cDNA序列，設計3條特異性引物SP1、SP2和SP3(表1)，采用染色體步移的方法，克隆到DhGMDS基因5′端上游啟動子區1 071 bp(圖5)，DhGMDS基因啟動子GenBank登錄號MZ363640。由Plant CARE在線軟件[27]分析結果可知 (表2)，在DhGMDS基因上游啟動子區含有基本元件 CAAT-box 和 TATA-box，光響應順式作用元件G-box和Box-4，與干旱、低溫脅迫相關的響應元件MYC、LTR等。此外，還有與轉錄因子MYB結合位點有關順式作用元件。

2.5 DhGMDS基因表達的qRT-PCR分析

對霍山石斛根、莖、葉、花中DhGMDS基因的相對表達量進行分析，結果(圖6，A)顯示，DhGMDS基因在不同部位均有表達，在花中相對表達量較高，其次是莖和葉，在根中的表達量最低，可推測DhGMDS基因為花中特異表達的基因。

對霍山石斛整株植物進行低溫處理，分析DhGMDS基因低溫響應情況。結果(圖6，B)表明，在低溫脅迫過程中，DhGMDS基因相對表達量迅速上調，后稍有下降，在低溫處理24 h時表達量最高。

3 討 論

多糖是霍山石斛主要活性成分，目前對霍山石斛多糖的研究多集中在藥理、藥效方面[28-29]，從分子角度解析霍山石斛植物體內多糖合成途徑尚無相關的深入研究。本研究以霍山石斛轉錄組數據為基礎，克隆霍山石斛關鍵酶基因DhGMDS，為進一步研究DhGMDS基因在霍山石斛多糖代謝中的分子調控機制提供理論基礎。系統進化分析顯示，DhGMDS蛋白與蘭科的黃花石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭聚為一類，說明DhGMDS基因序列在蘭科中的保守性相對較高，在基因進化中不屬于活躍型。實時熒光定量PCR分析顯示，DhGMDS基因在花中相對表達量較高，其次是莖和葉，在根中的表達量最低。然而通常認為莖是霍山石斛主要的藥用部位，這說明在藥用植物中含有主要有效成分的組織部位，其DhGMDS基因的表達量不一定高，該基因在霍山石斛中的表達存在組織特異性。

啟動子在基因表達調控中發揮重要作用，是RNA聚合酶識別、結合，并啟動下游基因進行轉錄的DNA序列[30]。DhGMDS基因啟動子的順式作用元件分析表明，其啟動子區除了含有基本元件，還含有多個逆境響應元件，如激素響應元件(脫落酸、水楊酸、乙烯)、低溫響應元件、干旱響應元件，推測DhGMDS基因可能參與植物逆境響應過程。有報道指出，白樺BpTCP7基因啟動子序列中具有低溫、干旱、激素響應等相關順式作用元件，進一步分析發現該基因參與逆境脅迫應答[31]。茶樹CsLEA5基因啟動子序列中包含與低溫、干旱等多種逆境響應相關的順式作用元件，分析發現該基因在低溫、干旱中發揮重要作用[32]。蔡國強等[12]采用 RNA-Seq 技術對高鹽脅迫下的發菜樣品進行轉錄組測序，發現相比較正常培養條件， GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在0.3 mol·L-1鹽濃度下轉錄水平提高了2.18倍，且多糖含量明顯增加，表明GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在發菜響應鹽脅迫過程中發揮了重要的調節作用。本研究qRT-PCR結果顯示，DhGMDS基因在低溫脅迫下顯著表達，脅迫24 h的相對表達量最高。由上可推測DhGMDS基因參與植物逆境響應過程。

DhGMDS基因啟動子中還含有 MYB轉錄因子識別位點, 大量研究證明MYB轉錄因子被認為是調節初級和次級代謝、防御和應對非生物脅迫及信號轉導的關鍵因子[33]。也有研究表明，蘋果中MdMYB88 和MdMYB124 通過CBF依賴和非依賴的信號途徑調節低溫應答基因的表達，從而增強蘋果的低溫抗性[34]，表明DhGMDS基因表達可能受 MYB轉錄因子的誘導。因此，推測低溫脅迫對霍山石斛DhGMDS基因的誘導表達可能依賴于上游的MYB轉錄因子的調控，其具體的調控機制如何，還有待進一步研究。

綜上所述，本研究克隆獲得了霍山石斛DhGMDS基因及其啟動子序列，并對其進行生物信息學分析和低溫脅迫應答分析，為進一步研究DhGMDS基因的功能，解析霍山石斛抗寒機制和遺傳改良提供理論依據。