外源硫化氫和水楊酸對鹽脅迫下加工番茄幼苗生長與生理特性的影響

張雪蒙，亢 超，滕元旭，陳靜怡，崔輝梅

(石河子大學 農學院，特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

土壤鹽漬化是限制植物生產潛力發揮的主要非生物逆境脅迫之一[1]。土壤鹽漬化使植物受不同程度脅迫傷害，鹽脅迫破壞植物體內離子平衡和細胞結構，制約根系水分和養分吸收利用，影響植物生長發育[2]。中國絕大部分加工番茄種植在西北地區鹽漬土壤中，而新疆又是中國最大的加工番茄種植和加工基地[3]。加工番茄作為新疆主要的特色經濟作物，對新疆農業經濟起著重要的作用[4]。因此，研究加工番茄耐鹽性，對指導加工番茄生產有實際意義。

作物鹽害或耐鹽機理的研究結果表明，化學調控手段是提高作物耐鹽性的有效措施之一[5]。水楊酸別名鄰苯羥基苯甲酸(SA)，是一種簡單的酚類化合物，它普遍存在于高等植物的細胞體內，參與植物的種子發芽、開花和生理生化離子吸收的生命進程，是植物主要的內源性調節因子[6]。研究表明，SA可以誘導植物系統性抗性(SAR)的產生、調節細胞抗氧化機制以及調控植物光合作用，從而增強植物對逆境脅迫的耐受性[7]。水楊酸能夠調控鹽脅迫下植物的抗氧化代謝，調控植物的抗鹽性，已在辣椒[8]、西瓜[9]、冬小麥[10]等植物的研究中得到證實。

近幾年的研究表明，H2S是植物體內繼 CO和NO后的第3種內源性氣體信號分子[11]。研究發現低濃度的H2S參與調控植物氣孔關閉、種子萌發和根系發育等多種生理過程以及緩解干旱、重金屬等逆境脅迫帶來的氧化損傷[12]；H2S可作為SA 的下游信號分子，參與調控擬南芥對Cd的耐受性和玉米對熱脅迫的響應[13]。潘東云等研究也發現H2S可作為 SA 的下游信號參與調控低溫弱光下黃瓜幼苗的光合作用[14]。然而SA和H2S兩種信號分子在植物響應鹽脅迫方面是否存在互作還鮮見報道。本研究以加工番茄幼苗為試驗材料，探討SA、H2S這兩種信號分子緩解鹽脅迫生理機制的相互關系，為提高加工番茄的耐鹽性提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

以課題組前期篩選的KT-7加工番茄品系為試驗材料；外源硫化氫(H2S) 供體為 NaHS，購自 Sigma 公司，其他化學試劑購于當地化學試劑公司。

1.2 試驗方法

試驗于2020年11月在石河子大學農學院試驗站進行。選取籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲害的加工番茄種子，41 ℃浸種3 h，后用10%高錳酸鉀溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗數次，再放入墊有濾紙的培養皿中，置于25 ℃發芽箱內催芽。當種子大約80%露白后，播種在以蛭石為主要基質的育苗盤中，待真葉完全展開后每天灑施營養液1次，當幼苗生長至3～4片真葉時，挑選長勢趨近一致的植株定植到Hoagland營養液中，每桶5棵苗，定植前需要用清水清凈幼苗根部的基質。幼苗定植恢復生長后進行不同處理。

在前期研究結果的基礎上，本試驗設置5個處理：CK，不添加處理試劑；NaCl，添加 150 mmol/L NaCl； H2S，添加150 mmol/L NaCl+ 50 μmol/L H2S；SA，添加150 mmol/L NaCl+0.15 mmol/L SA；H2S+SA，添加150 mmol/L NaCl+50 μmol/L H2S+0.15 mmol/L SA。每個處理3次重復(桶)。其中，NaCl和SA在處理時直接溶于營養液中，NaHS 溶液以葉片噴施的方式于每日 10:00 噴施。脅迫處理 6 d后各處理選取5株分別測定第4片完全展開葉的快速葉綠素熒光，然后摘下葉片，一部分用于電解質滲透率的測定，另一部分以液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存，用于其他生理指標的測定。試驗過程中每個水培桶24 h進行充氣泵充氣，營養(處理)液每2 d更換1次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 幼苗形態指標幼苗處理6 d 后，取樣3株測定株高、莖粗、苗鮮質量、根鮮質量，105 ℃殺青15 min，80 ℃烘干至恒重，測定苗干質量，根干質量。

1.3.2 葉片生理指標葉綠素含量的測定采用95%酒精浸提法測定[15]。葉片相對含水量測定采用稱重法[16]；葉片電解質滲透率測定采用電導法[17]；脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧陰離子產生速率和H2O2含量的測定參照高俊鳳[18]的方法。SOD活性測定采用氮藍四唑(NBT) 法；POD活性測定采用愈創木酚法；CAT、APX 活性測定參照文獻[19]的方法。

1.3.3 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線測定NaCl 處理6 d后，每個處理選取5株加工番茄幼苗進行測定。測定前先將葉片暗適應30 min，然后利用 M-PEA-2 多功能植物效率分析儀(Hansatech，英國)測定葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，將獲得的O-J-I-P熒光誘導曲線用于JIP-test分析，參照 Schansker[20]等的方法，通過快速熒光誘導曲線可以計算出每個 PSⅡ反應中心的光能吸收(ABS/CS)、激發能捕獲(TRO/CS)、電子傳遞(ETO/CS)情況。

1.4 數據統計分析

計算3次重復平均值和標準誤差。采用 Microsoft Excel 2010 進行原始數據處理，用 SPSS 19.0進行統計分析，用 Duncan’s 法進行差異顯著性檢驗，以平均值 ± 標準誤(Means ± SD) 表示，用 Origin2017作圖。

2 結果與分析

2.1 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗生長發育的影響

如表1所示，與對照(CK)相比，加工番茄幼苗的株高、莖粗、苗鮮質量、根鮮質量、苗干質量、根干質量在150 mmol/L NaCl脅迫處理(NaCl)下均顯著降低，而施加外源H2S、SA單一和復配處理(H2S+SA)均能在不同程度上增加鹽脅迫下加工番茄幼苗的生物量、株高和莖粗。其中，復配處理(H2S+SA)的效果最好，其株高、苗鮮質量和苗干質量分別比鹽脅迫處理(NaCl)顯著增加了36.59%、17.82%和28.53%。說明鹽脅迫會顯著抑制加工番茄幼苗的生長，而外源H2S、SA單一處理和復配處理均能有效緩解鹽脅迫對加工番茄幼苗的生長抑制，并在復配處理下的緩解效果最佳。

表1 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗生長發育的影響

2.2 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片相對含水量和脯氨酸含量的影響

圖1,A顯示，同CK相比，NaCl脅迫使加工番茄幼苗葉片中脯氨酸含量顯著增加；H2S、SA處理使幼苗葉片脯氨酸含量較NaCl處理分別顯著提高29.9%和27.52%；而在H2S和SA復配處理后，加工番茄幼苗葉片脯氨酸含量較H2S、SA單一處理分別顯著提高了17.49%和16.45%(P<0.05)。同時，加工番茄幼苗葉片的相對含水量在鹽脅迫下顯著降低(圖1,B)，在H2S、SA單一處理以及H2S和SA復配處理后均有所增加，但各處理間差異均不顯著，卻均顯著低于對照。說明單一或者復合施加外源H2S和SA能夠誘導加工番茄幼苗葉片滲透調解物質脯氨酸含量顯著增加，增強加工番茄抵御鹽脅迫的能力，有效緩解鹽脅迫傷害，且復合處理的效果更佳。

2.3 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗丙二醛含量和電解質滲透率的影響

由圖2，A可知，加工番茄幼苗葉片中MDA含量在NaCl脅迫下比CK顯著增加了79.21%，在H2S、SA和H2S與SA復配處理下分別較NaCl脅迫處理降低了30.84%、12.28%和38.15%，且單一H2S處理和復配處理的降幅達到顯著水平，并兩者的MDA含量與對照無顯著差異，其中以復合處理的緩解效果最佳。

同時加工番茄幼苗葉片電解質滲出率在NaCl脅迫下也比對照顯著升高(圖2，B)；與NaCl脅迫處理相比，H2S和SA單一處理可使加工番茄幼苗電解質滲出率顯著降低，降幅分別為15.61%、14.32%，但仍顯著高于對照；而H2S與SA復配處理會使幼苗電解質滲出率比單獨H2S和SA處理進一步顯著下降，并接近對照水平。以上結果說明外源H2S和SA單獨或者復配使用均可以有效緩解NaCl脅迫對細胞膜透性造成的破壞，且復合處理緩解鹽脅迫的效果更為明顯。

2.4 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗抗氧化酶活性和過氧化氫含量的影響

APX和CAT是植物體內清除H2O2的抗氧化酶，其活性受H2O2誘導。圖3顯示：加工番茄幼苗葉片內APX和CAT活性在NaCl脅迫下明顯增加，但增幅不顯著；在單獨施加外源H2S后，APX、CAT活性均比NaCl脅迫處理進一步增加，但未達到顯著水平；在SA單獨處理后，APX活性也比NaCl脅迫處理顯著上升，而CAT活性則比NaCl脅迫處理稍有降低，回復到對照水平；在外源H2S和SA復合處理后，APX和CAT活性與單獨處理和NaCl脅迫處理均無顯著差異。

同時，加工番茄幼苗葉片內SOD活性在NaCl脅迫下比對照顯著增加，而在施加單一H2S、SA后均比NaCl脅4迫處理不同程度降低，在H2S與SA復配處理下顯著高于H2S、SA單一處理，也稍高于NaCl脅迫處理。幼苗葉片內POD活性卻在NaCl脅迫下比對照顯著降低，在H2S、SA單一或者復合處理下均顯著高于NaCl脅迫處理，并恢復到與對照相近水平。

另外，NaCl脅迫會誘導加工番茄幼苗葉片H2O2的產生，其含量比對照顯著增加，造成氧化損傷；加工番茄幼苗葉片H2O2含量在H2S、SA單一或者復合處理下均較NaCl脅迫處理大幅度顯著下降，并恢復到甚至低于對照水平，且單獨SA處理和復合處理的降幅更大(圖3)。表明鹽脅迫條件下添加外源H2S、SA處理可顯著增強加工番茄幼苗葉片內APX、POD的抗氧化酶活性，有效去除體內產生的過多H2O2等活性氧，緩解鹽脅迫誘導的氧化傷害，且SA和H2S復配處理的效果更好。

2.5 外源H2S和SA對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉綠素含量的影響

由圖4可知，加工番茄幼苗葉綠素a、b、a+b和類胡蘿卜素含量在NaCl脅迫下均比CK有不同程度降低，但未達到顯著水平；在單獨施用外源H2S后，加工番茄幼苗葉綠素 a、b和a + b含量比NaCl脅迫處理分別顯著提升了14.39%、12.72%和13.97%，而單獨施加外源SA和復合處理后，各光合色素含量比單一鹽脅迫處理有所增加，但增加幅度均未達到顯著水平。說明外源施加H2S處理能夠有效緩解加工番茄幼苗因NaCl脅迫而引起的葉綠素含量下降。

2.6 外源H2S和SA對NaCl脅迫下番茄幼苗葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線及其參數的影響

2.6.1 葉綠素快速熒光動力學曲線在150 mmol/L NaCl脅迫下，加工番茄幼苗葉片葉綠素快速熒光動力學曲線在J相較對照處理未發生顯著的變化,各處理間熒光的差異在I相和P相之間較為明顯，單一NaCl處理下 J相、I 相和 K相的熒光值均低于對照(圖5，A)。說明NaCl處理下加工番茄幼苗葉片放氧復合體(OEC)受到了傷害。同時，由Vt繪制的OJIP曲線(圖5，B)可以看出，在O-J-I段，單一NaCl脅迫處理較對照處理明顯降低；而在外源H2S、SA處理及其復合處理則逐漸升高，說明外源SA、H2S處理下加工番茄葉片的受傷程度要低于單一鹽脅迫處理，且復合處理效果更明顯。

2.6.2 PSⅡ反應中心活性參數單位面積吸收的光能(ABS/CSm)、單位面積捕獲的光能(TRo/CSm)和單位面積電子傳遞的量子產額(ETo/CSm) 可以反映PSⅡ反應中心的狀況。從圖6可以看出，加工番茄幼苗葉片ABS/CSm、TRo/CSm 和ETo/CSm在鹽脅迫下均出現下降,降幅分別為5.25%、5.60%、3.24%，而在施加了外源H2S、SA后均有不同程度增加，但各處理之間及其與對照之間均無顯著性差異。這可能表明外源H2S與SA可以不同程度提高鹽脅迫下加工番茄葉片PSⅡ反應中心活性，增強其對鹽脅迫抗性。

3 討 論

硫化氫(H2S)、水楊酸(SA)是植物體內潛在的信號分子，均能在逆境條件下調節植物的代謝發揮重要的作用[21]。施加外源H2S[22]或SA[23]均可緩解鹽脅迫對植物生長的影響。植物在遭受鹽脅迫時，由于植物吸水能力的降低，會導致植物的生長受到抑制[24]。本研究表明，NaCl脅迫降低了加工番茄幼苗的生長和葉片的相對含水量。單一施加外源H2S或SA均能有效緩解鹽脅迫對加工番茄幼苗生長的抑制作用；當H2S和SA復配處理時，可顯著降低鹽脅迫對加工番茄幼苗的抑制作用，且與H2S或SA單一處理相比緩解效果明顯提高，表明SA和H2S共同作用下會進一步提高加工番茄幼苗對鹽脅迫的耐受性。

植物體內電解質滲透率和丙二醛含量的高低可以反映細胞膜脂過氧化強弱和細胞質膜受破壞程度，細胞質膜破壞會使細胞膜系統的完整性喪失，代謝功能紊亂[22]。鹽脅迫會破壞細胞內穩態環境，而抗氧化酶系統是植物應對鹽脅迫發生的一個重要的防御系統，它可以有效緩解脅迫環境對植物造成的損傷[25]。本試驗表明，單獨施用H2S和SA在緩解鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片的膜脂過氧化、保護酶活性和保護細胞膜結構方面效果幾乎相同，進而緩解了鹽脅迫對加工番茄幼苗的不利影響。同時施加H2S和SA處理在調節膜脂過氧化等方面顯著優于單一H2S、SA處理，說明H2S和SA復配處理對提高加工番茄幼苗的抗鹽性具有明顯的加性效應。這與在黃瓜[26]低溫脅迫上的研究結果相似。

脯氨酸作為植物細胞內一種重要的滲透調節物質，在植物受到鹽脅迫時會進行積累[27]。本研究顯示，單一施加外源H2S或SA均能顯著提高鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片的脯氨酸含量，而在H2S和SA復配處理下鹽脅迫番茄幼苗葉片的脯氨酸含量會進一步提高，這與Kaya Cengiz等的研究結果基本一致[28]。在本研究中，加工番茄幼苗在鹽脅迫處理后通過顯著提高H2O2產量表現出氧化應激；在鹽脅迫下，單一施加外源H2S、SA或二者的復配處理均顯著降低H2O2產量，表明他們可協同作用，去除H2O2并維持細胞氧化還原平衡。本研究中檢測到的抗氧化酶防御系統的主要依據是氧化應激，這是由鹽脅迫誘導H2O2的生成所引起的，表明加工番茄可以通過增加抗氧化防御系統活性在一定程度上緩解鹽脅迫造成的毒害。

外源施加SA可以誘導玉米內源H2S含量的積累，進而提高玉米幼苗的耐熱性，其中H2S與SA共同處理時緩解效果最佳[29]。本研究中H2S和SA復配在提高鹽脅迫加工番茄幼苗耐鹽性方面具有明顯的協同作用，至于H2S和SA協同處理提高植物耐鹽性的機理尚不明確，需更進一步探索。

4 結 論

本研究結果表明，鹽脅迫對加工番茄幼苗的各生理生化特性都有不利的影響。施加外源 H2S 和SA這 2 種信號分子在降低氧化應激、增強抗氧化防御系統和光合性能方面都具有積極作用，且二者在 NaCl 脅迫下存在著一定程度的協同作用。H2S和SA同時處理可降低植物葉片的失水，從而促進生物量的積累。同時，本研究還發現，H2S和SA復配處理可以誘導增加鹽脅迫下加工番茄幼苗的滲透調節能力，使加工番茄幼苗仍保持較完整的光合結構和較強的活力，進一步表明H2S和SA在減輕加工番茄鹽脅迫傷害方面存在相互調控的機制。