葡萄‘霞多麗’果實中黃烷-3-醇合成酶活性及其相關基因表達

沙曉蓉，張 萍，王云霞，卜虎柏，馬 瑩，靳 磊

(寧夏大學 農學院，銀川 750000)

釀酒葡萄是寧夏回族自治區的優勢特色產業，寧夏賀蘭山東麓作為中國葡萄酒“地理標志產品產地”之一，因其獨特的氣候、土壤條件，被業內公認為是世界釀酒葡萄栽培的“黃金”地帶[1]。‘霞多麗’(Chardonnay)是賀蘭山東麓主栽釀酒葡萄品種之一，其果實品質受到溫度、光照、水分、海拔高度和土壤養分等環境因素的影響[2]。果實成熟度、糖、酸、香氣及多酚是評價釀酒葡萄果實品質的主要指標[3]，葡萄酒“七分原料，三分釀”，葡萄品質是釀造優質葡萄酒的根基。黃烷-3-醇作為果實中含量最豐富的多酚類物質之一，是決定葡萄酒品質的一個重要因子，對葡萄酒澀、苦味的優劣和強弱，以及對葡萄酒的諸多感官品質[4]，如色澤、風味、澄清度、收斂性、褐變及貯藏壽命和穩定性都具有決定性作用[5-6]。同時，黃烷-3-醇能夠被人體快速吸收，有一定的藥理學作用和保健功能，如抗氧化性和清除自由基的活性[7-8]，抑制動脈硬化和保護心血管[9-10]，皮膚保健美容等作用，是葡萄果實和葡萄酒中非常重要的功能性成分[11-13]。因此，研究釀酒葡萄中酚類物質對葡萄酒的釀造具有指導意義。

目前，國內外學者對釀酒葡萄中酚類物質的研究比較廣泛，但是對與葡萄酒苦澀感相關的黃烷-3-醇類單體的定性定量研究較少。葡萄的成熟條件不同，葡萄中酚類物質的含量及類別也不相同，葡萄的適時采收將直接影響葡萄的質量，進而影響葡萄酒的品質，通過酚類物質的研究則可以對葡萄成熟度做出更加準確的判斷。前人[14-15]采用高效液相色譜法對葡萄果實中的黃烷-3-醇單體含量進行了測定，結果發現葡萄果實含有兒茶素[(-)-catechin, CAT]、表兒茶素[(-)-epicatechin, EC]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate, ECG]3種單體。鄧波[16]以‘赤霞珠’和‘蛇龍珠’葡萄品質為試材，研究不同品種葡萄部位中黃烷-3-醇類化合物單體CAT、EC、ECG含量的差異，結果表明不同品種葡萄部位中黃烷-3-醇類化合物單體的含量有明顯差異，‘赤霞珠’葡萄果皮和果梗中的CAT含量高于‘蛇龍珠’。李小龍[17]研究表明，在葡萄果實發育過程中，‘赤霞珠’種子內酚類物質總量總體呈下降趨勢，在幼果期其含量下降較為緩慢，果實成熟后期下降速率減緩并趨于穩定。黃烷-3-醇類物質是類黃酮代謝途徑的產物[18-19]，其生物合成是一個復雜的過程，由多個基因表達及相關酶綜合調控。秦晨亮[20]研究了赤霞珠果實不同發育階段果皮中酚類物質與其相關酶活性之間的關系，發現赤霞珠葡萄果皮PAL活性在生長發育過程中呈雙峰型變化趨勢，分別在花后35和80 d達到高峰。CHI基因表達水平隨著果實的發育而逐漸下降[21]。但前人對于葡萄果實中黃烷-3-醇類單體的研究主要集中在干紅葡萄上，而對白葡萄的研究報道較少。特別是白葡萄中黃烷-3-醇生物合成和積累與其合成相關酶及相關基因表達的關系鮮見報道。因此，研究白葡萄品種果實中黃烷-3-醇單體及含量的變化規律，探討其生物合成途徑及相關酶活性變化、相關結構基因的表達，對于‘霞多麗’等白葡萄品種資源開發及利用具有重要意義。

本研究應用HPLC技術，通過對白葡萄品種‘霞多麗’果實中酚類物質的定性定量分析來探討其在漿果發育過程中的變化規律和合成相關酶活性變化，同時利用qRT-PCR技術對果實發育過程中黃烷-3-醇生物合成相關結構基因進行定量分析，探討黃烷-3-醇含量變化與其生物合成相關酶及相關基因的關系，對闡明釀酒葡萄次生代謝產物生物合成過程具有重要意義，同時也為優質釀酒葡萄品種的培育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

寧夏賀蘭山東麓地區白葡萄品種‘霞多麗’果實采自銀川市美御酒業有限公司葡萄種植基地。葡萄樹常規水肥管理，冬天埋土防寒，避免凍傷，用寬行密株的栽培方式，株行距為0.5 m×3.0 m，單壁籬架栽培，每隔10～15 cm留1個結果枝，每個結果枝留1穗果。選取長勢一致的‘霞多麗’葡萄優良植株60株，花后20 d(2020年6月13日)開始采樣，每10 d采樣1次，共采樣8次。每次隨機選取3株，于植株東、西兩側分別采集果穗各1穗，共6穗。果穗采集后，去除機械傷害、病蟲害及發育異常果粒，裝入冰盒，迅速帶回實驗室用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 儀器與設備

Aglient 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Light Cycler 4801I型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)；Christ Alpha 1-4 LSC plus冷凍干燥機(德國Christ公司)；FRQ-1006單槽超聲波清洗機(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)；KH19A離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.3 葡萄果實中黃烷-3-醇單體含量測定

1.3.1 葡萄果實中黃烷-3-醇的提取將葡萄樣品用液氮研磨，冷凍干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存待用。稱取葡萄果實干粉1.0 g置于15 mL離心管中，加入10 mL 70%甲醇(HPLC)，搖勻，遮光超聲45 min(80 Hz)后離心15 min(4 ℃)，取上清液經0.25 mm濾膜過濾后上樣待檢。

1.3.2 黃烷-3-醇單體HPLC分析條件色譜柱采用Zorbax Eclipse SB-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm粒度色譜柱)；檢測波長為280 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，流速0.5 mL/min。梯度洗脫：流動相A為0.4%甲酸水溶液，流動相B為乙腈(HPLC)。洗脫程序：0～10 min，B 1%～10%；10～20 min，B 10%～20%；20～32 min，B 20%～35%；32～35 min，B 35%～100%；35～37 min，B 10%。

1.3.3 黃烷-3-醇標準曲線的繪制將20 mg沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素(CAT)、表兒茶素(EC)標品，加入2 mL 70%甲醇配成母液，將母液依次稀釋為100、50、25、10、5 mg/L的5個不同濃度梯度的溶液，把準確配置的不同濃度的標準品混合液在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，建立標準曲線，數據和結果見表1，所得液相圖譜見圖1。從表2可知，4種黃烷-3-醇單體的溶液濃度與峰面積相關系數均在0.994 3以上，說明相關性良好，可以滿足定量的需要。

表1 4種黃烷-3-醇的線性方程及相關系數

1.4 黃烷-3-醇生物合成相關酶活性的測定

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照何慕涵等[22]的方法，以U·g-1表示；查爾酮異構酶(CHI)活性測定參照高婭北等[23]的方法，結果以U·g-1表示；黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫類黃酮還原酶(DFR)活性測定參考劉美玲等[24]的方法，結果以μg·g-1·h-1表示；類黃酮3′-羥化酶(F3′H)活性測定參考何鳳平等[25]的方法，結果以U·g-1表示；花色素苷合成酶(ANS)活性測定參考杜麗娟[26]的方法，結果以U·g-1表示。

1.5 黃烷-3-醇生物合成相關結構基因表達分析

1.5.1 RNA提取葡萄果實總RNA的提取采用多糖多酚植物專用RNA提取試劑盒Quick RNAisolation Kit進行，具體步驟參見說明書。

1.5.2 cDNA的合成按照Reverse Transcription System Kit試劑盒說明，建立總體積為20 μL的反轉錄反應體系。首先在DEPC處理過的PCR管中加入總RNA 2 μL，再加入50 μmol/L Oligo(dT15)1.5 μL，變性10 min于70 ℃水浴中，立即冰浴2 min，離心，將液體收集于管底。依次加入4 μL 15xRT緩沖液、1 μL RNA酶抑制劑(Rnasin，20 μ/μL)、2 μL dNTPs(200 μmol/L)、1 μLAMV反轉錄酶、8.5 μL DEPC處理水于冰浴中。混勻后離心，將液體收集于管底，42 ℃溫浴1 h，99 ℃加熱5 min，滅活反轉錄酶，立即冰浴5 min，-20 ℃保存。

1.5.3 PCR引物設計根據Gene Bank中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮異構酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫類黃酮還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、類黃酮3′-羥化酶(F3′H)基因的全長序列，利用Primer 5.0設計PCR擴增引物(引物序列見表2)，經北京擎科生物科技有限公司合成。選擇Actin基因作為內參，對試驗結果進行標準化處理。

表2 實時熒光定量 PCR 引物序列

1.6 數據分析

每個測定指標3次重復，結果以“平均值±標準誤”表示，數據處理采用Excel 2010，利用SPSS19.0軟件進行方差分析(ANOVA)，Duncan多重比較方法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)，目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算；用Pearson相關性分析法揭示葡萄漿果發育過程中黃烷-3-醇積累代謝與基因表達量的耦合關系；用Excel 2010軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 ‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇含量的變化

由表3可知，霞多麗葡萄果實在整個發育時期，黃烷-3-醇類化合物GC、ECG含量大部分時間遠高于CAT、EC含量。其中，GC含量隨著果實發育整體呈先升高后下降趨勢，在花后40 d(7月3)日出現峰值(40.02 mg/g)，并與其余時期存在顯著差異，花后90 d(8月22日)比峰值時顯著減少了91.85%；ECG的含量在果實發育初期未檢測到，在花后50 d(7月13)時出現最高值(47.69 mg/g)并與其他時期差異顯著，隨后含量持續下降，且至花后90 d(8月22日)出現最低值，最低值比最高值顯著降低了53.87%；CAT含量總體呈降-升-降的變化趨勢，也在花后50 d(7月13日)時出現最高峰(18.68 mg/g)，并與其他時期相比差異顯著；EC含量的變化總體呈先升后降趨勢，同樣在花后50 d(7月13日)達最大值(42.73 mg/g)，比花后40 d(7月3日)增加了2.19倍，其最低值出現在花后20 d(6月13日)，僅為2.69 mg/g。

表3 ‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇類化合物的含量變化

2.2 ‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇生物合成相關酶活性的變化

黃烷-3-醇生物合成相關酶PAL、F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS活性測定結果(圖2)表明，PAL和ANS活性變化趨勢較為一致，均呈先升高后降低的變化趨勢，且在花后30 d(6月23)出現最大值，并與其他時期存在顯著差異；F3H、F3′H、CHI活性都在花后20 d(6月13)出現最大值，而后各酶活性迅速降低，說明花后20 d是‘霞多麗’酶促反應發生的關鍵時期；DFR活性先升高后降低，在花后50 d(7月13)再次升高，后隨果實成熟逐漸降低。另外，各種相關酶活性在8/2～8/22期間整體維持在偏低水平，且無顯著差異。

2.3 ‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇生物合成相關基因的表達特征

‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇生物合成相關基因的表達分析結果(圖3)顯示，在葡萄果實發育過程中，PAL、ANS基因的表達情況相似，均是在果實生長初期(6/13～6/23)上調，且表現為顯著上升趨勢，至花后30 d(6月23日)達到最高值，隨后表達水平大幅下降，總體呈下調趨勢并維持在較低水平；F3H、CHI基因表達均呈先下調后上調的趨勢，隨著果實成熟表達逐漸加強，CHI基因相對表達量在花后90 d(8月22日)達到最大值，而F3H基因的相對表達量在果實生長初期(6月13)具有最大值，并遠高于其余時期；F3′H基因的表達水平在果實生長初期快速下調，而后隨果實成熟逐漸上調，但仍始終顯著低于生長初期的最大值(6月13日)；DFR基因的表達水平隨著果實生育期顯著先上調，而后大幅度顯著下調，隨果實成熟再次上調，但仍始終維持在較低水平。

2.4 ‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇含量與生物合成相關酶活性和相關基因表達量的相關性

由表4可見，‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇單體GC含量與CHI、DFR基因相對表達量為負相關，與F3H、F3′H基因表達為正相關； ECG含量與ANS、PAL基因表達為正相關，相關系數較小分別為0.252、0.338，與F3H、CHI、DFR、ANS、F3′H基因表達為負相關；CAT含量與F3H、F3′H基因表達為正相關。但是，以上相關關系均未達到顯著水平。

表4 黃烷-3-醇含量與合成相關酶活性及相關基因表達量的相關系數

同時，GC含量與生物合成相關酶活性均呈正相關關系，其中F3H、F3′H和ANS活性與GC含量為顯著正相關，說明F3H、F3′H和ANS活性的提高可能對GC含量的積累有顯著促進作用；EC含量與合成相關酶均為負相關關系，ECG含量與合成相關酶均為正相關關系，而CAT含量與DFR、ANS和PAL酶活性呈負相關關系，與其他合成相關酶活性均呈正相關關系，但EC、ECG、CAT含量與生物合成相關酶活性的相關性均表達到顯著水平。

另外，黃烷-3-醇生物合成相關酶活性與相關基因表達量間，除DFR活性與CHI、F3H、F3′H基因表達量，PAL活性與F3′H基因表達量為負相關外，其他合成相關酶活性與基因表達量間均為正相關，其中CHI基因表達量與各合成相關酶活性間相關性較弱，其他基因表達量與黃烷-3-醇生物合成相關酶活性相關性較強，除個別酶外，二者相關性達到顯著或是極顯著正相關關系。

3 討 論

黃烷-3-醇是葡萄果實品質評價的一個重要指標，在決定葡萄酒的澀感、色澤及氧化等方面發揮重要作用[27-30]。本研究通過分析葡萄漿果發育過程中黃烷-3-醇單體含量的積累及相關酶基因的表達特征，為‘霞多麗’葡萄功能成分的綜合開發利用提供依據。趙權[31]研究結果表明，黃烷-3-醇類化合物含量在葡萄果實整個發育過程中呈下降趨勢。‘夏黑’葡萄果實中黃烷醇含量在花后21 ～42 d迅速增加至峰值，之后隨果實成熟逐漸下降，幼果期含量顯著高于成熟期[32]。本試驗結果表明，在‘霞多麗’葡萄果實發育的不同階段，其黃烷-3-醇類物質在花后50 d之前積累最多，可能是因為這一時期的呼吸作用和新陳代謝強烈，之后檢測出的GC、ECG、CAT、EC含量均隨果實成熟下降，這與Fujita等[33]和Cadot等[34]的研究結果一致。‘赤霞珠’葡萄果實在生長成熟過程中，兒茶素處于先積累，后下降至平穩狀態，表兒茶素沒食子酸酯具有不穩定性，總體呈下降狀態[6]。本研究中ECG在‘霞多麗’葡萄果實發育初期未檢測到，可能是因為這一時期ECG含量比較低；CAT含量隨著葡萄的成熟總體呈減少趨勢，這與王美麗[35]的研究結果相似；CAT等具有較強的抗氧化、抗衰老、抑菌等功能[36]，若考慮葡萄果實的功能作用，在完全成熟前采收是較好的時期。

酚類物質是葡萄中重要的次生代謝物，其生物的合成和積累受到相關基因的調控， PAL、F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS是黃烷-3-醇合成的相關酶，大量研究表明其基因參與了葡萄黃烷-3-醇的合成調控。彭東[37]、王愛華[38]等研究表明煙葉PAL活性隨煙葉成熟而增強，成熟后隨煙葉衰老而降低，本研究表明，‘霞多麗’果實發育過程中黃烷-3-醇生物合成相關酶PAL活性呈先升高后降低的變化趨勢，這與前人的研究結果相似；其余合成酶F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS活性均隨著葡萄成熟而降低，可能是由于隨生育期的延長體內生理代謝活動減弱所引起的。本研究同時發現，隨著‘霞多麗’葡萄果實的成熟，酚類物質生物合成相關基因的表達也發生變化，這些基因的表達差異導致黃烷-3-醇積累模式的變化。其中，ANS基因表達量先上調后下調，后隨果實成熟逐漸上調，但仍低于花后20 d，這與馬雅娜[39]研究結果相似。

已有研究表明，石榴在果實發育期間ANS基因的表達與花色苷含量呈顯著正相關[40]，PAL基因的表達與煙葉中的類黃酮含量呈顯著正相關[23]。在本研究‘霞多麗’葡萄果實中，F3H、F3′H和ANS活性與GC含量達顯著正相關水平，表明F3H、F3′H和ANS活性對GC含量的積累影響較大。ANS、PAL基因的表達量與其ECG、GC含量呈正相關，即黃烷-3-醇含量與結構基因表達量呈正相關關系，說明該基因可能是影響黃烷-3-醇含量的主要結構因子，對ECG、GC含量合成的調控作用較強，基因表達量越高，越容易促進黃烷-3-醇類物質的生物合成。另外，F3H基因表達量與F3′H活性，PAL基因表達量與DFR、ANS活性之間也存在極顯著正相關關系。因此可根據F3H、F3′H和ANS活性和ANS、PAL基因的表達量高低來判斷‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇的合成積累水平。

綜上所述，在‘霞多麗’葡萄果實發育過程中，黃烷-3-醇單體含量隨果實成熟逐漸下降，黃烷-3-醇類物質的積累與葡萄果實中其生物合成相關酶活性及相關基因表達有關。F3H、F3′H和ANS活性與‘霞多麗’葡萄果實中GC含量為顯著正相關；F3H、F3′H基因可能促進GC、CAT的合成，ANS、PAL基因促進ECG、GC的合成，CHI、DFR基因抑制GC的合成。總之，黃烷-3-醇生物合成的相關酶活性和相關基因表達影響了葡萄果實中黃烷-3-醇類化合物含量的積累，從而進一步影響葡萄酒的感官品質。