CRISPR/Cas9基因組編輯技術在番茄中的應用現狀及展望

蔣 萌，付尚譚，王曉峰

(西北農林科技大學 園藝學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

近年來隨著分子生物學的不斷發展，基因編輯技術基于其高效、可控、定向編輯的特點在植物學和農學領域得到了廣泛應用。該技術利用序列特異識別的核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)使特定位點的DNA雙鏈發生斷裂，從而啟動兩種高度保守的自身修復機制，即非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組修復(homologous directed repair，HDR)。真核生物中DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSBs)的修復多為NHEJ的方法，即通過DNA連接酶直接連接DSBs末端，但相比于需要同源序列模板的HDR，精確度更低[1]。基因編輯技術主要有3種類型，即鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技術、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術及規律成簇間隔短回文重復序列及其關聯蛋白系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)。與CRISPR/Cas相比，ZFNs和TALENs在編輯效率、穩定性、成本及復雜程度上都有其無法克服的缺點。

CRISPR/Cas技術2013年開始應用于植物基因組編輯，加速了人們對植物基因組中特定DNA序列定向編輯的步伐，被Science雜志評為十大科學突破之一[2]。其中應用最為廣泛的是CRISPR/Cas9系統，目前已經在水稻、玉米、小麥等多種作物中得到應用[3-6]。

番茄(Solanumlycopersicum)是中國及世界上最主要的蔬菜之一，其生命周期較短，遺傳簡單，具備成熟的遺傳轉化技術。自2014年CRISPR/Cas9首次應用于番茄基因編輯后，在基因功能研究和種質資源創新領域得到了大量的應用[7]，但編輯效率低等問題依然限制了其進一步發展。本綜述將總結近幾年CRISPR/Cas9技術在番茄中的應用現狀，并討論該技術在番茄中應用的前景及面臨的問題。

1 CRISPR技術簡介

近年來，CRISPR/Cas9基因組編輯技術被廣泛地應用于多種生物體的基因編輯，以對基因功能進行基礎研究和創建動植物育種的新材料。從1987年在堿性磷酸酶同工酶基因中發現CRISPR序列后[8]，經過不斷地探索和改進，最終將CRISPR/Cas基因編輯技術應用于編輯目標基因。根據Cas基因的數量和功能之間的不同，CRISPR/Cas系統被分為兩類，第一類是需要多種蛋白的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型系統，第二類是僅需單一蛋白即可編輯雙鏈的Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型CRISPR/Cas系統[9]。目前應用最為廣泛的是來自Ⅱ型CRISPR/Cas9系統，該系統主要由crRNA(CRISPR RNA)與tracrRNA(trans-activating crRNA)結合后形成雙鏈二級結構進行Cas9蛋白的招募，共同形成活性核糖核蛋白(ribonucleoproteins，RNPs)復合體并識別PAM(protospacer adjacent motif)區，隨后Cas9蛋白發揮其DNA核酸內切酶的活性，進行DNA雙鏈的切割，由此產生DSB觸發DNA修復機制。CRISPR/Cas9基因組編輯技術應用的核心是構建Cas9/sgRNA表達載體，將載體導入受體細胞并發揮編輯作用[10]，用于植物的Cas9核酸酶主要由35S啟動子或組織特異性啟動子等強啟動子驅動，而sgRNA一般由聚合酶Ⅲ轉錄的U6啟動子驅動，多重靶點編輯一般通過串聯sgRNA連接至相應載體中表達[11-12]。隨后通過農桿菌介導轉化、農桿菌葉片注射法等方式導入受體細胞。

2013年，Science雜志報道了CRISPR/Cas9在小鼠等動物中的應用[13]，同年NatureBiotechnology雜志報道了在水稻、模式植物本氏煙草和擬南芥中的基因定點編輯[14-15]，并于2014年首次應用于番茄基因編輯[7]。目前，CRISPR/Cas9的應用主要集中在生物和非生物脅迫響應以及性狀改良等方面，通過編輯編碼序列位點產生無效等位基因突變體，最終應用于改良作物品種。

2 CRISPR/Cas9系統在番茄中的應用現狀

CRISPR/Cas9技術近幾年在番茄中的應用主要為農藝性狀改良及抗逆、抗病基因功能研究，表1中列舉了這三方面的應用。

表1 CRISPR/Cas9在番茄中的應用

2.1 CRISPR/Cas9在番茄農藝性狀改良中的應用現狀

番茄傳統育種需要花費大量的時間和精力將優良性狀賦于目標品系，還會連鎖引入一些不需要的不良性狀，而CRISPR/Cas9技術能夠快速精準地創制應用于各品系各位點的新種質資源[16]。番茄基因組的測序使研究人員能夠利用CRISPR/Cas9技術定點精確調控植株形態、生長發育、果實性狀等農藝性狀，從而得到優異的番茄種質資源。不僅如此，番茄作為一種研究漿果果實發育和果實成熟的模型，其性狀改良對其他作物農藝性狀改良也具有參考價值。

2.1.1 調控植株形態葉型影響番茄的植株形態和光合效率，Brooks等[7]利用CRISPR/Cas9技術編輯番茄SlAGO7基因，導致葉型發生改變，并發現突變能夠穩定遺傳，首次證明了CRISPR/Cas9系統在番茄中的強大功能。株高是作物重要農藝性狀，矮化番茄植株較小，適宜盆栽，觀賞價值高，CRISPR/Cas9編輯赤霉素信號轉導的負調節因子PROCERA能夠獲得矮化突變體，自交獲得T1代植株，雜合子在苗期表現出野生型和純合子之間的中間表性，意味著突變為半顯性，而發育后期純合子雜合子矮化程度相同，隨后通過自交獲得了無Cas9構建的矮化番茄植株，為番茄優良矮化品種的培育提供了先例[17]。

2.1.2 改良果實性狀果實作為番茄的經濟器官，其性狀直接影響生產者的經濟效益，其中果實保質期的延長，果實品質及果色的改良對經濟效益影響較大。

續表1 Continued Table 1

CRISPR/Cas9基因組編輯技術被應用于研究果實成熟相關基因功能，如RIN(ripening inhibitor)[18-19]、RING2[20]、ALC(alcobaca)[21]、ORRM4(organelle RNA recognition motif-containing 4)[22]以及NAM1[23]，敲除突變體果實延遲成熟，為培育貨架期長的番茄耐貯藏品種提供材料。為了檢測基因在果實發育中的特異功能，開發了果實特異性的CRISPR/Cas9系統，該系統以PPC2基因的啟動子驅動Cas9基因表達，并結合GFP檢測系統。使用該系統對植物發育產生多種影響的EZ2(zeste)基因進行編輯，對其在番茄果實中的功能進行探究，檢測到果實成熟的延遲[24-25]，初步確認了果實特異性編輯的可行性，為番茄果實相關基因功能研究建立了新的研究方法。

可溶性糖是番茄果實品質中很重要的一個性狀，INVINH1(inhibitor of the acid invertase gene)基因特異性抑制細胞壁轉化酶活性，SlVPE5(vacuolar processing enzyme)負向調節糖的積累，均抑制果實可溶性糖積累。CRISPR/Cas9編輯驗證SlINVINH1和SlVPE5功能，結果表明，比起SlINVINH1和SlVPE5單突變體，雙突變體能進一步提高番茄果實中可溶性糖積累，二者表現為協同作用，為提高番茄果實品質提供實驗依據[26]。此外，葉綠素數量增加能夠通過增強光合作用提高植物的營養品質和果實顏色。Liu等[27]得到了一個葉綠素減少的突變體，發現是SlRCM1(reduced chlorophyll mutant 1)基因所導致，該基因的敲除系果實在綠熟期表現出黃色，為改善果實品質提供了一個新思路。番茄紅素是決定番茄果實品質的重要因素，SGR1(stay-green1)、LCY-E(lycopene E-cyclase)、BLC(beta-lycopene cyclase)、LCY-B1(lycopene B-cyclase1)、LCY-B2是番茄紅素代謝途徑中的關鍵基因，設計6個sgRNA并利用CRISPR/Cas9系統進行敲除，其中sgr1單突變體的番茄紅素含量增加約5.1倍，多重突變體也不同程度地增加了番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量，在提升果實營養品質方面有實際應用價值[28]。

隨著人們生活水平的提高，消費者對果色的要求也隨之提高，粉果番茄更受中國消費者的歡迎。柚皮苷查爾酮(naringenin chalcone，NarCh)缺失造成番茄果實呈現粉色，對NarCh合成相關基因SlMYB12(myeloblastosis 12)進行編輯得到粉紅果實突變體，且沒有檢測到突變體主要農藝性狀及果實品質的變化，同時建立了基于CRISPR/Cas9系統的粉果番茄快速育種系統，為日后通過基因編輯改良農藝性狀提供了一個很好的實例[29-30]。八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase，PSY)和類胡蘿卜素異構酶(carotenoid isomerase，CRITOSO)參與類胡蘿卜素合成途徑，利用CRISPR/Cas9分別敲除紅果番茄的PSY1和CRTISO，獲得了黃色和橙色果實的突變體[31-32]。

2.1.3 調節生長發育番茄地上部分器官的分化和發育由莖端干細胞決定，CLV/WUS(clavata/wuschel)途徑調控莖端分生組織的增值和分化。CLV3通過抑制WUS的表達限制干細胞增殖，SlCLE9(clavata 3/embryo)通過緩沖SlCLV3對干細胞增值的限制來維持干細胞穩態，使用CRISPR/Cas9編輯SlCLE9和SlCLV3發現雙突變體表現出莖粗增大、葉片及分枝增多，并發現SlCLE9和SlCLV3之間的主動補償效應[33]。Hendelman等[34]進一步研究WUS相關基因在發育中的調節功能，利用CRISPR/Cas9創造大量敲除SlWOX8(wuschel-related homeobox 8)和SlWOX9啟動子等位基因的突變體，揭示了該基因在生長發育方面的多效性，同時發現了新花序表型。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的含量與發育相關，選擇GABA代謝途徑中的5個基因進行敲除，得到的多個突變體組合均能夠顯著提高GABA含量，抑制花、葉、果實的生長發育，驗證了GABA在發育中的功能，證明了多敲系統的高效性[11]。此外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteins kinases，MAPKs)在調節植物生長發育、分裂等過程發揮著重要作用，但其在植物發育過程中的功能還不清楚。利用CRISPR/Cas9徹底敲除SlMPK20，發現突變體花粉生存能力被抑制，探究了SlMPK20基因在花粉發育調控中的作用[35]。MIR(MICRORNA)基因轉錄后加工產物微小核糖核酸(MicroRNAs，miRNAs)，作用范圍廣泛，調控植物發育、生物非生物脅迫等生物過程。CRISPR/Cas9分別編輯miR164a、miR164b和miR164 d，發現miR164a影響果實大小硬度等性狀，而miR164b能夠維持花芽正常發育，并在果實生長調控中和miR164a發生冗余，揭示了miR164在發育和果實性狀中的作用[36]。

2.1.4 雄性不育及單性結實品種培育番茄雜種優勢明顯，但雜交制種需大量人力物力，雄性不育系的創制能夠節省這部分成本，同時提高雜交種子純度。Du等[37]鑒定并敲除雄蕊特異基因SlSTR1創建了雄性不育系，并通過自交剔除了T-DNA，同時創建通過幼苗顏色區分育性的保持系，建立了基于CRISPR/Cas9的番茄雜交制種系統。最近我們團隊使用CRISPR/Cas9技術靶向育性基因MS1035(male sterile)及其連鎖的標記基因創建了具有綠色下胚軸標記或下胚軸多毛表型的雄性不育系。創制的不育系能夠通過可視化標記在苗期區分出不育植株，且應用于雜交制種后能夠獲得高純度雜交種，推動了CRISPR/Cas9在創制番茄雄性不育系及生產雜交種子中的應用[38]。近期研究發現，GDP-l-半乳糖磷酸化酶(GDP-l-galactose phosphorylase，GGP)調控抗壞血酸含量，CRISPR/Cas9誘導GGP突變導致植株花器官結構受損，進一步研究表明植株高抗壞血酸含量損害花粉活力，為雄性不育系的培育提供了新思路[39]。

單性結實即無需授粉子房直接形成無子果實，能夠避免花粉活力對坐果率的影響。AGL6(agamous-like6)基因被證明與番茄單性結實有關，CRISPR/Cas9敲除AGL6產生了果實質量等性狀未受影響的單性結實材料，驗證了AGL6賦予番茄的單性結實能力[40]，并據此對SlAGL6介導的單性結實機制進行了深入研究[41]。類似的，Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)轉錄因子SlIAA9的下調激活番茄單性結實，CRISPR/Cas9敲除獲得的單性結實突變體顯示出果實無核的表型，研究發現該突變能夠穩定遺傳至下一代，并快速應用于番茄各品種[42]。

2.1.5 多性狀改良品種培育CRISPR/Cas9能夠一次性編輯調控番茄生長發育、產量及營養方面的多個基因，同時優化番茄多個性狀。Kwon等[43]利用CRISPR/Cas9同時編輯SlER(erecta)、SP(self-pruning)和SP5G(self-pruning 5G)，獲得株型緊湊，外觀更像灌木，40 d內能夠收獲成熟果實且不影響產量的番茄植株，創建了一種適宜城市農業的番茄材料，能夠滿足現代化都市生存與發展需要。野生番茄具有很好的抗逆性，但品質方面還需改良，Zs?g?n等[44]選擇野生番茄品種，靶向其形態方面的6個基因，得到了大量形態、果實數量、果實形狀及營養物質發生改變但保留了野生品種抗逆性的突變體。其次，該團隊還提出利用CRISPR/Cas9技術能夠使番茄產生辣椒素，提高番茄營養價值和抗菌能力[45]。這些結果表明了CRISPR/Cas9技術在番茄育種中具有很高的應用價值。

2.2 CRISPR/Cas9在提高番茄抗逆性中的應用現狀

番茄生長發育經常面臨干旱、高溫、低溫等多種逆境條件，嚴重影響番茄的正常生長發育，因此提高番茄抗逆性一直是育種的主要目標。CRISPR/Cas9技術推動植物抗逆相關基因功能及逆境脅迫機制等理論研究，并最終服務于番茄抗逆育種。

2.2.1 提高抗旱性干旱是對番茄生長發育最具破壞性的非生物脅迫。MAPK級聯系統通過信號轉導參與調節植物抗旱反應。CRISPR/Cas9誘導的SlMAPK3突變體中，檢測到了過氧化氫的含量減少及熱脅迫耐受性降低[46]，此外，病原體防御反應調控因子SlNPR1(nonexpressor of pathogenesis-related 1)的CRISPR/Cas9敲除突變體，也得到了類似結果[47]。證明SlMAPK3和SlNPR1響應干旱脅迫，賦予植株一定程度的抗旱能力，這些耐旱相關基因的編輯，凸顯了基因組編輯技術在調節植株抗旱性中的可行性，但還未得到進一步應用。

植物激素對植物生長發育起著重要調節作用，其通過與外部環境之間相互作用提高植株對一定程度環境脅迫的適應能力[48]。油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)信號通路的重要轉錄因子BZR1(brassinazole resistant transcription factor 1)參與抗旱調節，CRISPR/Cas9誘變SlBZR1，突變體缺少熱應激耐受性，且過氧化氫的含量減少、熱脅迫耐受性降低[49]。證明SlBZR1是抗旱性正調控因子。氮響應負調控因子LBD(lateral organ boundaries domain)參與茉莉酸(jasmonate，JA)信號傳導，CRISPR/Cas9介導的SlLBD40基因突變，提高了植株抗旱性，證明了SlLBD40是抗旱性的負調控因子[50]。最近一項研究利用CRISPR/Cas9技術編輯赤霉素受體蛋白基因GID1(gibberellin-insensitive dwarf1)，得到在缺水條件下保持較高水平葉片含水量的番茄植株，有效提高了番茄抗旱能力。在此基礎上深入探究了赤霉素(gibberellin，GA)與番茄抗旱之間的關系，發現干旱脅迫下，植物體內GA水平降低，通過減少葉面積，促進氣孔關閉，減少木質部增殖和擴張，以減少木質部水力傳導等多種機制減少蒸騰作用，從而提高植株耐旱性[51]，但這些抗旱相關基因之間的關系還有待進一步研究。

2.2.2 提高抗寒性寒冷也是影響植物生長發育和產量的重要環境因素之一。CBFs(CRT binding factors)是一種存在于各物種中的冷響應因子，利用CRISPR/Cas9技術編輯SlCBF1基因得到的突變體對低溫脅迫的耐受性和敏感度下降[52]，突變體脯氨酸含量、過氧化氫含量和抗氧化酶活性等生理指標測定也驗證了這一結果，同時檢測到JA、ABA等激素含量的提高。這些結果有助于更好地探究SlCBF1在抗冷機制中的作用方式。過表達光合碳同化關鍵酶SBPase能夠提高植株耐寒性，而利用CRISPR/Cas9創建的突變體slsbpase則對冷害更加敏感，突變導致植株體內抗壞血酸和谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成酶活性及其編碼基因轉錄豐度的降低，并抑制AsA-GSH再循環，這些結果支持SlSBPASE中的突變通過抑制 GSH 生物合成和 AsA-GSH 再循環來加劇低溫誘導的氧化應激，并表明 SBPase 是番茄植株對低溫脅迫的最佳響應所必需的[53]。

2.2.3 提高抗鹽性鹽堿脅迫會對農作物整個生長周期造成不同程度的抑制，限制農作物產量和質量。HyPRPs(hybrid proline-rich proteins)是鹽脅迫反應的負調控因子，CRISPR/Cas9精確調控SlHyPRP1使番茄在萌發和營養階段表現出高鹽度耐受性[54]。SlHAK20(high-affinity K+20)位于4號染色體前端，具有鈉鉀離子轉運體功能，能夠維持植物組織中的K+和Na+穩態，利用CRISPR/Cas9進行敲除，發現該基因與番茄耐鹽性相關，為解釋耐鹽分子機制以及耐鹽品種的選育提供了重要依據[55]。

2.2.4 提高抗除草劑能力根寄生雜草對農作物產量和質量影響很大，MAX1(more axillary growth 1)基因是獨腳金內酯(strigolactone，SL)合成基因，而SL是根寄生雜草萌發所必需的誘導劑。設計靶向SlMAX1基因第3個外顯子的sgRNA，得到SlMAX1敲除突變體，發現該突變體SL水平降低，并獲得對根寄生雜草分枝列當(Phelipancheaegyptiaca)的抗性，為有效控制根寄生雜草提供了新方法[56]。

2.2.5 提高多種非生物脅迫抗性植物通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除機制減輕非生物脅迫帶來的損害，其穩態調節因子CGFS 型谷氧還蛋白(CGFS-type glutaredoxin，GRX)，CRISPR/Cas9靶向誘變分析番茄4種GRX基因(SlGRXS14、SlGRXS15、SlGRXS16和SlGRXS17)，其中SlGRXS14和SlGRXS17突變體對熱、寒冷、干旱、重金屬毒性、營養缺失和短光周期等非生物脅迫都更敏感，而SlGRXS16突變體主要對寒冷更加敏感，為通過基因工程方法提高番茄對多種非生物脅迫的耐受性提供了新思路[57]。

2.3 CRISPR/Cas9在提高番茄抗病性中的應用現狀

近年來，番茄病害發生逐年增多，根據病原體可分為真菌病、病毒病和細菌病等，這些病害嚴重影響了番茄產量，CRISPR/Cas9系統的應用有效提高番茄對不同類型病原體的抵抗力。

2.3.1 提高真菌病抗性番茄白粉病主要危害葉片，該病害通過在葉片上形成霉斑來影響光合作用，直接影響植株生長發育。研究表明番茄Mlo(mildew resistance locus o)基因家族SlMlo1是白粉病易感基因，利用CRISPR/Cas9技術敲除SlMlo1，10個月內即可得到白粉病抗性很強的非轉基因番茄[58]。在此基礎上，研究人員引入多敲系統創制抗病突變體，構建雙靶點CRISPR/Cas9系統靶向SlMlo1，成功獲得SlMlo1大片段缺失且完全抗白粉病的突變體[59]。此外，白粉病易感基因PMR4(powdery mildew resistance 4)的缺失導致抗病性增強[60]，多靶點CRISPR/Cas9系統編輯SlPMR4的敲除突變體顯著地提高了白粉病抗性。證明了CRISPR/Cas9基因組編輯技術能夠快速且有效地提高植株對真菌病抗性。

致病疫霉(Phytophthorainfestans)所引起的的番茄晚疫病是一種嚴重的番茄真菌病害，主要影響設施番茄產量。miRNAs能夠通過抑制其靶基因提高植物抗性，利用多重編輯系統同時敲除miR482b和miR482c，發現雙突變體比單突變體抗性更高，揭示了miRNAs調控抗性新機制[61]。此外，CRISPR/Cas9驗證了SlMYBS2對致病疫霉的正向調控作用，并推測SlMYBS2通過SA和JA信號通路抵抗致病疫霉[62-63]。CRISPR/Cas9技術還可用于更多番茄致病疫霉相關基因功能的進一步驗證中。

基因組編輯技術還被應用于提高尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)所導致枯萎病[64]以及灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)所導致的灰霉病抗性[65]。CRISPR/Cas9編輯產生的Sloyc08g075770突變體對枯萎病敏感性更高[64]。此外，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)在植物抗逆中起信號傳遞作用，研究人員推測MeJA相關轉錄因子MYC2(myelocytomatosis protein 2)參與調控植株抗逆，CRISPR/Cas9技術介導的SlMYC2突變，降低了突變體果實抗灰霉病能力和抗氧化酶活性，證明該基因在MeJA誘導的番茄果實抗灰霉病過程中起正調控作用[65]。此外，最近研究發現果膠裂解酶基因PL(pectate lyase)的CRISPR/Cas9敲除將植株對灰霉病的易感性降低了50%以上[66]。

2.3.2 提高病毒病抗性番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄生產中的一種毀滅性病害。CRISPR/Cas9能夠靶向TYLCV基因組從而提高植物抗病性[67]，此外通過靶向番茄TYLCV基因組的復制酶Rep(replicase)及外殼蛋白CP(coat protein)，賦予突變體TYLCV抗性，其中CP位點的突變效率更高[68]。在此基礎上利用誘導型啟動子構建CRISPR/Cas9表達載體，靶向TYLCV的基因間區域IR(intergenic region)和CP序列，檢測到病毒的積累減少或發生延遲[69]。除此之外，研究人員通過QTL定位(quantitative trait locus)鑒定了抗性連鎖的一系列位點，使用CRISPR/Cas9敲除Ty-5位點編碼的SlPelo(pelota)基因，其缺失也能有效抑制TYLCV病毒增殖[59]。

除直接干擾病毒基因組外，小型RNA在病毒防御中的作用也值得探討。DCL(dicer-like)作為加工酶參與RNA沉默，其中擬南芥DCL2能夠將內源性和病毒性dsRNA(double-stranded RNA)加工成22-nt的sRNA(small RNA)，從而造成病毒RNA沉默[70]。為了研究番茄DCL2在抗病中的功能，使用CRISPR/Cas9編輯番茄DCL2四個亞家族(SlDCL2a-SlDCL2d)中表達量最高的SlDCL2b，顯著增強了番茄對番茄花葉病毒(tomato masaic virus，ToMV)的抗性[71]，同時編輯SlDCL2a和SlDCL2b則顯著提高番茄對馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)和煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的抗性[72]。研究認為SlDCL2是番茄抗病毒病途徑中的關鍵組成部分，證明CRISPR/Cas9在創建番茄多重抗病品種方面有著很大的潛力。

2.3.3 提高細菌病抗性丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)是細菌性葉斑病的致病菌，它通過釋放冠毒素COR(coronatine)引起植株氣孔的張開，從而利于細菌的侵染。JAZ(jasmonate-ZIM)結構域蛋白是COR共受體，運用CRISPR/Cas9編輯SlJAZ2，使其缺少JAZ結構域，突變體對細菌性葉斑病產生抵抗力[73]。

黃單胞菌(Xanthomonaseuvesicatoriapv)引起番茄瘡痂病，PUB(plant U-box)在多種作物中正向調控植株抗病性，CRISPR/Cas9敲除SlPUB24，突變體顯示出黃單胞菌屬T3族易感性，因此認為SlPUB24是一種黃單胞菌屬T3族抗性基因，為抗瘡痂病抗病機制研究提供基礎[74]。此外，CRISPR/Cas9編輯抗性(resistance，R)基因Rx4，發現Rx4蛋白識別黃單胞菌屬T3族病原體后，激活防御機制超敏反應(hypersensitive response，HR)，從而提高瘡痂病抗性，亦為瘡痂病抗病機制研究提供參考[75-76]。

2.3.4 提高植株多重抗病能力傳統育種依賴于單一R基因，而易感基因S(Susceptibility gene)更具持久和廣譜抗病性。CRISPR/Cas9技術提供了一種多重抗病材料的創建策略，其誘導的番茄S基因SlDMR6-1突變，賦予番茄更強的細菌、卵菌和真菌等不同類型的病原體抗性[77-78]。此外，CRISPR/Cas9誘導的乙炔酶編碼基因ACER1a和ACET1b突變顯示出對真菌和細菌病原體的抗性的增加[79]。

總而言之，這些研究結果體現了CRISPR/Cas9在抗病性方面的強大功能，該技術能夠幫助科研人員探索病原體發病機制和植物體抗病機制，對農業可持續發展起到了很大的推動作用[80]。

3 CRISPR/Cas9系統存在的問題及改進方法

隨著CRISPR/Cas9技術的不斷發展，其應用范圍的擴大也成了一個熱點問題，CRISPR/Cas9系統編輯特異性的提高、轉化系統的優化以及新型基因編輯系統的開發等方法能夠降低CRISPR/Cas9技術應用的局限性。

3.1 編輯效率的提高

盡管CRISPR/Cas9具有精確高效的特點，但由于Cas9核酸酶在一定程度上可以容忍sgRNA與靶序列之間的錯配，直接導致編輯精確性下降。雖然在植物中比較少見[81]，但研究人員還是開發了各種方法以降低脫靶效應。

穩定的sgRNA能夠更準確地引導RNPs，Moreno-Mateos等[82]分析發現富含G而缺乏A的sgRNA更加穩定，設計sgRNA時應避開poly-T序列、限制GNGG序列，此外截短sgRNA也能降低脫靶效應[83]。此外，使用兩種不同的Cas9酶進行編輯也能夠極大地減少脫靶效應[84]。脫靶效應也與靶點序列設計相關，各種軟件網站被開發以進行更具有特異性的靶點設計[82]。研究人員還開發出多靶點系統，通過串聯sgRNA，靶向單個基因不同靶點，更徹底地進行基因編輯。此外，優化Cas9表達啟動子[85]，誘導劑誘導HDR修復途徑[86]，預測網站的應用[10]等也能提高基因編輯精確性。

3.2 轉化系統的優化

目前，導入CRISPR系統比較成熟的方法是通過農桿菌介導的轉化，該方法雖然能夠使Cas9和sgRNA在植物體內穩定表達，但轉化效率較低。Yu等[21]提出病毒介導的基因組編輯系統能夠簡化繁瑣的轉化過程，Ma等[87]將SpCas9和gRNA插入到SYNV病毒基因組中，成功應用于煙草，編輯效率能夠達到40%～91%。CRISPR/Cas9的瞬時轉化能夠實現無轉基因編輯，Yuan等[88]建立雙生病毒復制子和雙終止子的高水平瞬時轉化系統，通過農桿菌侵染在番茄中瞬時表達，進行目標基因的編輯，該系統提高了編輯效率以及后代無Cas9植株的比例。此外，遺傳轉化過程中的生長條件改變也促進了突變的增加[3]。

3.3 新型基因編輯技術的發展

為了解決CRISPR/Cas9的限制性問題，新的基因編輯技術也在不斷地被發現，如幾乎沒有脫靶效應的CRISPR/Cpf1[89]以及能夠精準編輯的堿基編輯技術(base editing，BE)[90]等。

Zetsche等[91]發現Cpf1系統，將其歸為CRISPR的第2類Ⅴ型，又被稱為CRISPR/Cas12a。該系統使用單一RNA引導核酸內切酶，產生具有5′突出的粘性末端，促進NHEJ機制精確地編輯基因。此外該核酸酶本身是RNase能夠切割RNA，且分子量小能夠方便地進入細胞，擴大了CRISPR的應用范圍[92]。此后還開發出了多種高效Cas12a[93]，以提高編輯效率，擴大PAM區域識別范圍。CRISPR/LbCpf1的雙生病毒多重復制子系統的使用成功編輯番茄耐鹽相關的SlHKT1;2等位基因，且有效提高了HDR的基因組編輯效率，為無轉基因編輯鋪平道路[94]。Bernabé-Orts[95]證明了CRISPR/Cas12a能夠在番茄中進行基因編輯，并且沒有檢測到脫靶效應，能夠作為CRISPR/Cas9的替代工具，該系統還被應用于ToMV和番茄棕褐色果實病毒(tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)的特異性檢測[96]。

BE也在多種作物中得到了應用[97-98]，該技術基于CRISPR/Cas9系統，能夠實現單個堿基替換。與CRISPR相比，BE不依賴于DSBs的產生，無需供體DNA參與并更具高效性和廣泛適用性[90]。Shimatani等[99]將CRISPR/Cas9和活化誘導的胞苷脫氨酶AID(activation-induced cytidine deaminase)融合，將該系統命名為Target-AID，利用該系統進行編輯，得到的突變體在靶位點發生點突變，證明了BE在作物改良方面的可行性。乙酰乳酸合酶ALS(acetolactate synthase)賦予番茄對磺酰脲類除草劑氯磺隆抗性，且精確堿基編輯效率高達71%，其中12.9%的番茄植株無T-DNA插入[98]。在番茄中靶向類胡蘿卜素代謝途徑中的3個基因(SlDDB1、SlDET1和SlCYC-B)同時導入堿基置換突變，增加了番茄果實中類胡蘿卜素含量，證明了Target-AID堿基編輯技術能夠高效編輯多個基因[100]。Lu等[101]在番茄中利用Prime Editing技術實現了精準的堿基替換或刪除，該團隊引入熒光報告基因通過基因槍法進行轉換，優化了植物密碼子和啟動子，從而大大提高編輯效率。

此外，更加高效的CRISPR/Cas12f1[102]以及TnpB[103]等系統也被開發。這些新型系統能夠識別更多的PAM序列，結構更加簡化，擴大了基因編輯的應用范圍。通過基因編輯系統不斷地更新，在番茄上使CRISPR系統成為一個常規化的技術將是一項長期持續的工作。

4 展 望

對植物活體基因組的定向編輯是長期以來農學上實現基因優化的重大難題，CRISPR/Cas9基因組編輯技術能夠高效而簡單地解決這一問題，使我們對基因功能的研究和農藝性狀的優化有了一個不可替代的有力工具。一直以來轉基因技術的應用都存在著很大的爭議，但CRISPR/Cas9基因組編輯技術不引入外源基因，能夠產生無T-DNA插入的編輯后代，這為使用生物技術手段創建優異的非轉基因材料提供了嶄新的途徑。因此CRISPR/Cas9基因組編輯技術將在番茄等重要作物上獲得廣泛的應用。2016年4月，CRISPR/Cas9創建的蘑菇通過了美國農業部的認證，也讓基因編輯在育種方面的應用受到了很大的鼓舞[104]，使得CRISPR/Cas9的道德討論及法律制約也在不斷完善。

目前基因編輯技術已經在抗病、抗逆方面以及改良農藝性狀方面取得了很大的成就，加速了農作物的馴化，提高了番茄商業價值。與傳統的基因沉默技術如RNAi及VIGS技術相比，CIRSPR/Cas9技術能夠更加精確地對目標基因進行編輯，多敲系統的引入則能夠更加徹底地對目標基因進行敲除。此外，CRISPR/Cas9技術創建的突變體能夠穩定遺傳，從而更準確地研究目標基因的功能，保證了科研的嚴謹性。盡管機遇與挑戰并存，但CRISPR/Cas9的時代已經到來。