組蛋白去乙酰化酶抑制劑對肝癌誘導自噬的作用

莊 薇 鐘 寧

1 江西衛(wèi)生職業(yè)學院(南昌 330052)

2 江西省腫瘤醫(yī)院(南昌 330006)

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病之一，在我國，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率較高，占全球的50%左右[1- 2]，每年我國有逾13萬人死于該疾病[3]。原發(fā)性肝癌在早期不易察覺，隨后的病情進展迅速，這導致原發(fā)性肝癌的預后差，5年生存率只有12%左右[4- 5]，嚴重損害了人們的健康與生命。因此，我們的努力方向就是要明確原發(fā)性肝癌的發(fā)生原因和進展機制，為肝癌尋找到新的治療途徑已然成為醫(yī)療領域的研究熱點。曲古霉素作為一種新型的抗腫瘤藥物，屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑的一種，其具有抑制多種惡性腫瘤進展的作用[6- 7]，但是具體的作用機制還不是十分明確。本實驗旨在觀察曲古霉素對肝癌細胞增殖和凋亡是否有影響，該影響是否與自噬有關，這個作用機制可為臨床上治療肝癌開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞 HepG2(ATCC公司)；曲古霉素(Sigma公司)；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT試劑(Sigma公司)；Western blot相關試劑(Sigma公司)；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博公司)；RT和逆轉錄等相關試劑(Fermentas公司)；β-actin(Abcam 公司)；引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將人肝癌細胞 HepG2置于含有10%FBS、青霉素與鏈霉素各100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，然后置于CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2、37 ℃進行培養(yǎng)，進行傳代。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

把處于對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞鋪滿96孔板孔底，置于CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2、37℃進行培養(yǎng)，等到細胞貼壁后依次加入濃度梯度的藥物，即濃度為50、100、200和500 nmol/L的曲古霉素，使用曲古霉素處理 HepG2 細胞的同時對照組加入相同量的培養(yǎng)液，每一組濃度均設3個平行復孔。待48 h后每孔均加入 20 μL MTT (5 mg/mL)，維持條件不變繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后終止培養(yǎng)，吸棄其上清后，每孔中加入150 μL的二甲基亞砜，輕微振蕩10 min，運用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm 波長處各孔的吸光度(optical density, OD)的值，OD值的大小與活細胞數(shù)量呈正相關。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

使用 Annexin V/PI細胞凋亡雙染試劑盒來檢測細胞凋亡的總體情況，仍然是使用處于對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞，將其分別接種于6孔板中，等到細胞貼壁后依次加入濃度梯度的曲古霉素，48 h 后用離心管收集細胞離心，條件5 min、1 000 r/min，棄去上清后用200 μL流式染色緩沖液重懸細胞，然后再依次加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，輕輕搖晃混勻，注意室溫避光保存，務必在30 min以內用流式細胞儀進行檢測。

1.5 Western blot法

此階段處理細胞的方法同1.4，結束培養(yǎng)后細胞中加入RIPA裂解液，充分地震蕩，12 000 r/min，離心10 min后收集上清，隨即進行蛋白定量，可置于- 80 ℃冰箱中貯存。進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結束轉膜而后室溫下封閉2 h，加入一抗以后4 ℃孵育過夜；孵育一抗的膜使用緩沖液充分沖洗，隨后加入相應的二抗孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑，用凝膠成像并用圖像分析系統(tǒng)檢測，截取圖片并記錄相關條帶灰度值。

1.6 RT-PCR法

處理細胞的方法同1.4。引物序列從Gene Bank中查閱，根據(jù)引物設計原則設計。β-actin：上游5′-GTGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACT- 3′，下游5′-ATGGCATGAGGGAGCGCGTAACCCTCA-TAG- 3′；Beclin1：上游5′-GACCAGTGGGCATCGCA-TCG- 3′，下游5′-CTGGTTGGCTGATGCTACTG- 3′；Bcl- 2：上游5′-TGCCACCATCACTCAATACC- 3′，下游5′-AAACGCCAATAGCACGGTGA-3′。實驗過程使用Trizol一步法提取細胞的RNA；具體操作過程參照RT試劑盒程序進行RT及PCR反應，所得的cDNA可置于- 20 ℃冰箱保存以待后續(xù)實驗使用；以cDNA為模板，在聚合酶的催化下進行PCR擴增反應，反應條件為：95 ℃ 2min；95 ℃ 30 s，退火30 s，70 ℃ 1 min，70 ℃，2 min。反應結束后取PCR擴增產物6 μL，配制瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠成像以及圖像分析系統(tǒng)成像并進行檢測，計算各mRNA的表達情況。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 TSA對HepG2細胞增殖的影響

不同濃度的曲古霉素分別作用于HepG2肝癌細胞后，我們可以觀察到HepG2肝癌細胞的增殖情況，隨著藥物作用時間的延長以及藥量的增加增殖所受到的抑制越明顯，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=237.69，P<0.05，表1)。

表1 不同濃度TSA 對HepG2細胞增殖的抑制

2.2 TSA對HepG2細胞凋亡的影響

利用流式細胞術檢測不同濃度的 TSA 對 HepG2細胞凋亡的影響。與對照組相比較，200 nmol/L TSA 處理細胞以后，其凋亡百分數(shù)增加(F=335.14，P=0.041，圖1)。

圖1 TSA對HepG2細胞凋亡率的影響

2.3 TSA對HepG2細胞Beclin1和Bcl- 2蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，不同濃度的 TSA(100、200 nmol/L) 在處理HepG2細胞48 h以后，Beclin1蛋白的表達逐漸上調(F=511.93，P=0.029)，差異有統(tǒng)計學意義，而Bcl- 2蛋白的表達逐漸下調(F=197.24，P=0.032)，差異也有統(tǒng)計學意義 (圖2、圖3)。

圖2 HepG2細胞Beclin1和Bcl- 2蛋白的表達

2.4 TSA對HepG2細胞Beclin1和Bcl- 2 mRNA表達的影響

RT-PCR結果表明，不同濃度的TSA(100、200 nmol/L) 處理HepG2細胞48 h以后，Beclin1mRNA的表達逐漸上調(F=258.41，P=0.039)，差異有統(tǒng)計學意義，Bcl- 2 mRNA的表達在逐漸下調(F=1 082.62，P=0.04)，差異也有統(tǒng)計學意義 (圖3)。

圖3 HepG2細胞Beclin1和Bcl- 2mRNA的表達

3 討 論

細胞凋亡是一種主動過程，是由基因所控制的一種細胞自主而有序的死亡，其目的是為了維持內環(huán)境的穩(wěn)定，涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是一個極其復雜的過程。迄今為止我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的凋亡可以由現(xiàn)有的大多數(shù)抑制腫瘤的藥物所誘導，這也是這些藥物治療腫瘤的途徑之一。因此，我們評價腫瘤治療是否有效的指標之一就是看這個藥物能否誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[8]。細胞自噬是細胞在缺乏能量或者外界刺激等因素作用下的一種自我消化的過程，通過自噬的作用，生物機體可以將自身的蛋白、細胞器以及細胞質包裹、消化和降解，由此實現(xiàn)細胞器更新以及自身代謝的目的。自噬很少發(fā)生，可以由某些因素所誘導，細胞保持一種自噬對于細胞本身以及機體內環(huán)境的穩(wěn)定具有非常重要的生物學作用[9]。與此同時自噬不僅僅可以維持細胞的穩(wěn)態(tài)，同時它還可以誘導細胞的死亡[10]，在腫瘤細胞中，這種現(xiàn)象尤為明顯，自噬可以緩解腫瘤細胞增殖帶來的壓力，但是同時自噬又會誘導細胞的死亡，而這種死亡與細胞凋亡以及一般的細胞程序性死亡不同，它是一種新的程序性細胞死亡，人們稱其為細胞自噬性死亡[11- 12]。

研究顯示，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳調控起著非常重要的作用，這是一種不改變DNA序列，但是卻可以影響基因轉錄活性的調控方式，表觀遺傳調控的現(xiàn)象有很多，組蛋白乙酰化(和)或去乙酰化修飾就是其中一種，組蛋白及非組蛋白乙酰化會保持一種平衡，這種平衡的打破與腫瘤的發(fā)生以及惡性進展有著密切關聯(lián)，目前該靶點有望成為治療腫瘤的新途徑，已然成為目前抗癌治療和腫瘤靶向治療聯(lián)合用藥領域的新熱點。組蛋白去乙酰化酶抑制劑是通過提高細胞內組蛋白的乙酰化程度，誘發(fā)DNA損傷、抑制腫瘤細胞的增殖、誘導細胞分化和(或)凋亡，從而最終導致腫瘤細胞死亡。有研究顯示，組蛋白去乙酰化酶抑制劑對腫瘤細胞的自噬、凋亡和細胞程序性死亡這三種途徑均有顯著影響，其誘導的自噬可以發(fā)揮細胞毒性作用，促進細胞的死亡，與自噬抑制劑聯(lián)用或敲除自噬調控的關鍵基因Atg5基因均會減弱組蛋白去乙酰化酶抑制劑的細胞毒性作用[13- 14]。曲古霉素就是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，它最主要的作用就是抗真菌，此外對陰道滴蟲、梅毒螺旋體以及阿米巴原蟲也有一定的作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌等多種腫瘤亦具有抑制作用[15]。曲古霉素可以誘導多種腫瘤細胞發(fā)生自噬，但是其誘導的自噬與細胞死亡之間的聯(lián)系，在不同的用藥以及不同性質的腫瘤細胞中均存在著一定差異，這個環(huán)節(jié)還需要我們進行進一步的探究。

目前的研究表明，存在著某些自噬基因在腫瘤細胞中異常表達,許多抗腫瘤藥物治療途徑都是通過誘導腫瘤細胞的自噬，從而導致細胞死亡而實現(xiàn)的[16- 17]。Beclin1作為一種自噬基因，是候選的腫瘤抑制基因，也是目前所發(fā)現(xiàn)的參與自噬調控的關鍵靶點之一，其在多種腫瘤細胞中均有所表達[18]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌、乳腺癌以及前列腺癌中均存在Beclin1基因的缺失性突變，Ding等[19]研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中Beclin1的表達會明顯低于其周邊正常組織，而且肝癌的惡性程度與Beclin1表達的水平有相關性，在同步進行的細胞試驗中還證實了Beclin1的表達與腫瘤細胞的侵襲能力和轉移能力相關。任寧等[20]研究同樣證實了這個觀點，他們通過體外培養(yǎng)肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)自噬可以抑制肝癌細胞的增殖。Beclin1還能夠與凋亡相關蛋白Bcl- 2結合形成 Beclin1/Bcl- 2 復合體，參與調控細胞的自噬和誘導細胞凋亡。

通過本實驗我們可以看到曲古霉素能明顯抑制HepG2肝癌細胞的增長，且這種抑制作用會隨著曲古霉素作用時間的延長、藥量的增加而逐漸增強，這就告訴我們曲古霉素是可以抑制HepG2肝癌細胞繁殖的。在使用了200 nmol/L的曲古霉素處理HepG2細胞48 h以后，RT-PCR與WB法檢測結果均顯示自噬基因Beclin1 mRNA及蛋白的表達均上調，而抑凋亡蛋白Bcl- 2 mRNA及蛋白的表達均下調，且差異均具有統(tǒng)計學意義。這說明在TSA作用于HepG2細胞的過程中，凋亡與自噬兩種方式同時存在，且兩種方式會相互影響，可能是TSA通過干擾Bcl- 2/Beclin1復合體的結合，誘導自噬的同時促進了細胞凋亡的發(fā)生。